[发明专利]基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗有效
申请号: | 201810885988.2 | 申请日: | 2018-08-06 |
公开(公告)号: | CN108939064B | 公开(公告)日: | 2021-12-10 |
发明(设计)人: | 汪川;沈海浅 | 申请(专利权)人: | 南京颂悦生物科技有限公司 |
主分类号: | A61K39/39 | 分类号: | A61K39/39;A61K39/12;A61P35/00;A61P31/20;C12N1/21;C12N15/74;C12R1/01 |
代理公司: | 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 | 代理人: | 赵荣之 |
地址: | 210000 江苏省南京市高新区*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 基于 重组 绵羊 李斯特 宫颈癌 治疗 疫苗 | ||
1.基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗,其特征在于,其有效成分为携带HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因的重组减毒绵羊李斯特菌;
所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得;
所述重组减毒绵羊李斯特菌的制备方法,是以减毒绵羊李斯特菌为载体,携带HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因而得;具体步骤如下:
(1)合成HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因片段;
(2)构建打靶质粒;
(3)制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ;
(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化;
(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证;
步骤(1)的具体方法是:从NCBI上查询HPV 16型E6蛋白和E7蛋白氨基酸序列,再通过软件,从中筛选出优势T细胞抗原表位依次排列,然后根据李斯特菌密码子进行相应优化得到优化后的序列,再在其上游加入HindⅢ酶切位点,下游加入XhoⅠ酶切位点,将上述设计好的序列最后通过合成直接获得,共866bp,如SEQ ID NO.1所示;
步骤(2)的具体方法是:用限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ双酶切步骤(1)获得的融合抗原表位肽基因片段,同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pCW203,经连接、转化等技术将融合抗原表位肽基因片段插入pCW203 HindⅢ和XhoⅠ酶切位点,得到中间质粒pCW203-E6E7,如SEQ ID NO.2所示,通过PCR验证、提质粒验证、酶切验证证实中间质粒的成功构建;切下中间质粒pCW203-E6E7的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间的片段插入重组质粒pCW154的BamH I酶切位点与Xho I酶切位点之间,得到打靶质粒pCW154-E6E7,如SEQ ID NO.3所示;
步骤(3)的具体方法是:将LiΔactAplcB-lacZ用含0.5mol/L蔗糖的BHI液体培养基进行培养,定期测定A600,当A600=0.4时,加入盘尼西林G,使其终浓度为12.5μg/ml继续培养;当A600=0.7时,离心,洗涤,分装,保存即可。
2.根据权利要求1所述的疫苗,其特征在于,步骤(4)的具体方法是:取打靶质粒电转至LiΔactAplcB-lacZ感受态细胞中,电转完成后加入BHI肉汤培养2小时;转化液涂布于红霉素BHI琼脂平板,通过蓝白斑筛选出单个蓝色菌落,纯培养后进行质粒提取和PCR验证。
3.根据权利要求1所述的疫苗,其特征在于,步骤(5)的具体方法是:将携带打靶质粒的绵羊李斯特菌,在42℃和30℃连续传代,利用同源重组杂交原理和基因打靶技术,将打靶质粒携带的目的片段整合至李斯特菌中,利用蓝白斑及红霉素敏感性筛选出可疑菌株;然后进行PCR筛选和基因测序验证。
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