[发明专利]基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗

说明书

本发明涉及一种基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗。本发明以减毒绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，简称Li)为载体，利用李斯特菌独特的能在宿主吞噬细胞胞内生长，是天然的T细胞免疫活化佐剂的特性，有效提高在肿瘤微环境中的特异性免疫应答，打破机体的免疫耐受，从而清除机体持续性病毒感染，达到清除病灶，遏制肿瘤发展的良好治疗效果。其优势在于弥补了核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低的缺点，减毒的李斯特菌保留了原始菌株能在胞内生长，完成抗原递呈的特性的同时又具有更高的安全性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗。

背景技术

宫颈癌严重威胁着全球女性的健康，是死亡率仅次于乳腺癌的妇科恶性肿瘤。研究表明，HPV是宫颈癌的主要危险因素，有超过90％的宫颈癌患者伴随着高危型HPV的感染，其中以16型和18型为主。宫颈癌90％的癌症类型为宫颈鳞癌，其主要致病型为HPV16型。HPV的主要致癌因子为E6和E7蛋白，E6通过抑制肿瘤抑制因子p53的活性破坏正常的细胞周期调控，促使细胞永生化；E7蛋白通过结合并降解pRb蛋白使其失去抑癌作用。E6、E7自HPV感染早期持续高表达且仅表达与HPV感染组织中使其成为制备宫颈癌治疗性疫苗的理想靶标。

治疗性疫苗与传统的治疗手段，如外科手术，放化疗相比具有伤害小，毒性低的特点。目前治疗性疫苗的存在形式主要有三种：蛋白质多肽疫苗、病毒(细菌)疫苗以及核酸疫苗。其成功的关键是引起足够的免疫应答，但是目前的核酸类及蛋白质多肽类疫苗免疫原性较低，缺陷明显。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

基于重组减毒绵羊李斯特菌的宫颈癌治疗性疫苗，其有效成分为携带HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因的重组减毒绵羊李斯特菌。

优选的，所述减毒绵羊李斯特菌为绵羊李斯特菌(Listeria ivanovii，简称Li)完整敲除actA和plcB这两个毒力基因而得。

优选的，所述重组减毒绵羊李斯特菌的制备方法，是以减毒绵羊李斯特菌为载体，携带HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因而得。

进一步优选的，具体步骤如下：

(1)合成HPV16型E6E7融合抗原表位肽基因片段；

(2)构建打靶质粒；

(3)制备感受态细胞LiΔactAplcB-lacZ；

(4)利用步骤(2)制备的打靶质粒对步骤(3)制备的感受态细胞进行电转化；

(5)LiΔactAplcB-lacZ与打靶质粒同源重组杂交培养、筛选验证。

更进一步优选的，步骤(1)的具体方法是：从NCBI上查询HPV 16型E6蛋白和E7蛋白氨基酸序列，再通过软件(如使用CTLPred和NetMHC 4.0软件分析序列中可能的CTL表位；ProPred和NetMHCIIpan 3.1软件分析序列中可能的Th表位)，从中筛选出优势T细胞抗原表位依次排列，然后根据李斯特菌偏好密码子表进行密码子优化得到优化后的序列，再在其上游加入HindⅢ酶切位点(AAGCTT)，下游加入XhoⅠ酶切位点(CTCGAG)，将上述设计好的序列最后通过合成直接获得。其中，密码子优化方法是将氨基酸序列提交到网站(如http://www.jcat.de/)，然后选择绵羊李斯特菌偏好密码子优化选项即可实现；DNA序列的合成方法是：使用ABI 3900-Thermo Fisher Scientific等型号的基因合成仪直接合成DNA序列，共866bp，如SEQ ID NO.1所示。

更进一步优选的，步骤(2)的具体方法是：