[发明专利]一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种转染试剂及其制备方法和应用，所述转染试剂组成为：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽、终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。本发明能够显著提高具有单一溶酶体逃逸效应的非病毒载体的转染效率，进而提高核酸的递送效率；此外，本发明采用分子自组装方法，可以方便的大规模制备转染复合物，而且该复合物在生物体内可降解，具有较高的使用安全性。

技术领域

本发明属于基因工程领域,尤其涉及一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用。

背景技术

细胞转染技术指将带有目的基因的外源DNA或RNA掺入宿主细胞而使细胞获得新遗传标志的方法。它是分析细胞内基因、基因产物、蛋白表达功能的重要分析工具。细胞转染的主要目的是通过增强或抑制细胞中特定基因的表达来研究基因、基因产物及重组蛋白的功能。细胞转染技术在基因工程领域具有巨大的应用价值，例如通过基因疗法将目的基因转染进细胞来治疗疾病或改善患者的症状，通过中国仓鼠卵巢细胞获得的人组织纤溶酶原激活物等。

迄今研究开发的基因载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类，目前最常用的非病毒性转染介质是脂质体和阳离子聚合物，它们的特点和病毒类似，容易透过细胞膜。病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒、疱疹病毒、腺相关病毒等，虽然转染效率高，但存在着在人体内有自我复制的风险；而非病毒载体由于容易大规模制备、成本低、对外源基因无大小限制、具有低免疫原性和相对安全等优点，由于病毒介质的局限性，阳离子聚合物转染试剂日益受到重视。

阳离子聚合物可作为一种非病毒载体,具有类细胞结构和生物膜的特性,在体内可降解同时可以保护其运载基因片段的生物活性,而且操作简单、重复性好，是一种有临床应用潜力的基因转染载体。阳离子聚合物(cationic polymers)转染原理是带正电的聚合物与核酸带负电的磷酸基团形成带正电的复合物后与细胞表面带负电的蛋白多糖相互作用并通过内吞作用进入细胞。常用的阳离子聚合物有聚L-赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺(PEI)、树状病毒包膜糖蛋白聚合物、壳聚糖等。

但因为细胞毒性非常大，在体内转染过程中引起血细胞凝固等问题，现有的阳离子聚合物不能同时具备安全低毒和高效转染两个基本要求，因此，在很大程度上限制了其应用。

病毒包膜糖蛋白B(Envelope glycoprotein B,gB)，可通过结合哺乳动物细胞表面广泛存在的受体上，例如通过哺乳动物各种细胞上的乙酰肝素粘多糖(heparin sulfateproglycan，HSPG)介导病毒入侵过程，而且gB糖蛋白可以在不依赖其他病毒囊膜蛋白的情况下独自发挥功能。同时gB与宿主细胞的结合也可以不依赖HSPG，同时gB还可结合到细胞整合素(integrin)或表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)从而促进病毒入侵过程。尽管病毒包膜糖蛋白肽本身可以快速和高效的进入细胞，但是其结合和装载siRNA或质粒DNA的能力有限，单独使用转染多肽无法高效运输siRNA或质粒DNA。

发明内容

有鉴于病毒转染的安全风险、阳离子聚合物的低效和对细胞毒副作用，本发明公开了一种非病毒转染试剂及其制备方法和应用，所述非病毒转染试剂可以提高转染效率，同时减少单用一种阳离子聚合物对细胞的毒副作用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种非病毒转染试剂，包括：终浓度为10～50ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为0.1～20μg/ml的重组多肽、终浓度为5～80ng/ml的阳离子脂质体。

进一步的，所述非病毒转染试剂，包括：终浓度为20ng/ml的阳离子聚合物、终浓度为8μg/ml的重组多肽、终浓度为40ng/ml阳离子脂质体。

进一步的，所述非病毒转染试剂的阳离子聚合物是基于质子海绵效应的一种或任意配比的多种阳离子聚合物。