[发明专利]一种AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途

说明书

本发明属于基因工程和细胞工程技术领域，具体为一种AAV‑DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途。本发明使用商业化的AAV‑DJ型腺相关病毒对人和小鼠的类器官进行体外平面化侵染，完成感染后再将平面化培养的类器官重新用3D培养体系培养72小时。最后采用荧光共聚焦显微照相技术结合流式细胞术检测类器官的感染效率。结果表明，AAV‑DJ病毒可以在体外高效感染人和小鼠的类器官，感染效率可达80％，甚至更高，远远优于已报道的类器官基因操作工具，为类器官体外研究的学者们解决了一大难题，也为肝脏再生的临床研究打下坚实的基础。

技术领域

本发明属于基因工程和细胞工程技术领域，具体涉及一种AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官的用途。

背景技术

类器官是一种接近于体内生理条件，具有自我更新能力和自我组织能力，且具有相应组织器官功能的一类细胞团。类器官来源原代组织，胚胎干细胞和诱导多能干细胞中的其中之一，并依赖人工胞外基质（ECM）自我组织恢复成原始组织细胞结构。与传统的体外培养不同，类器官具有和原代组织类似的细胞组成和结构，并且包含小部分具有稳定基因组，自我更新和分化潜能的干细胞。另外一个重要的特点是类器官可以在体外无限扩增并可以和普通细胞一样进行冻存。另外，类器官基于ECM培养方式也提供了一种可以体外探究细胞微环境对类器官生长的影响。

这些独特的优势使得类器官在学术研究和工业技术中得到了广泛的应用。通过获取少量的器官组织，便可在体外迅速扩增得到大量的类器官，用于干细胞行为研究，药物筛选，疾病模型建立和遗传筛选。从健康人体和病人中获取的类器官还可以建立类器官样本库，供世界范围内的研究者进行相关研究。

类器官的基因工程改造是将具有功能基因片段高效导入类器官，经过表达后发挥功能。以CRISPR/Cas9修复囊泡纤维症病人来源的肠道类器官为例，将Cas9质粒，打靶质粒以及sgRNA导入类器官，Cas9蛋白发挥作用，将突变的CFTR位点修复，从而使其恢复正常生理功能。但是目前类器官导入外院基因的手段主要集中：1. 脂质体转染；2. 逆转录病毒感染；3. 电击转化等。其中，脂质体转染和电击转化都要求较高的细胞数目，并且最高效率只有30%，逆转录病毒感染后基因会整合至基因组，无法去除。

AAV因其无致病性、低免疫反应性、感染宿主广泛，瞬时表达效率高等优势，成为基因治疗领域应用前景最好的载体之一。但是AAV基因组存在包装容量有限，对多数组织转导效率不尽如人意等主要缺陷，成为困扰AAV在临床应用中的瓶颈问题。AAV-DJ型是一种经过随机同源重组和进化筛选得到的一种具有广泛感染效力的腺相关病毒。然而，针对AAV体外高效感染类器官的研究相对较少，因此，提供一种AAV体外高效感染类器官的方法，成为现阶段迫切需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种AAV-DJ病毒在体外实验中的一种新用途，即体外高效感染类器官，在一些实施方式中，感染效率最高可达到80%以上

本发明提供的AAV-DJ型腺相关病毒体外高效感染类器官用途，所述的类器官为人和小鼠的上皮类器官，具体地，包括肝脏类器官、肠道类器官和肾类器官。具体步骤为：

（1）将刚脱离3D培养的类器官与AAV-DJ病毒感染液混匀，然后平面化共孵育，完成感染过程；

（2）感染完成后，类器官脱离平面化状态，重新回到3D立体培养的状态；

（3）经过3D培养48~72小时后，类器官经过固定，染色，制片，然后用荧光共聚焦显微镜观察拍照GFP荧光；类器官经过洗涤，消化，重悬，用于流式细胞术检测GFP阳性细胞群的比例，即感染效率。

步骤（1）中所述的AAV-DJ病毒感染液是将商业化的AAV-DJ（购于Vector Biolabs，货号：7078）按照需要感染的类器官细胞数目进行一定的比例稀释（一般为1:400~1:20，即20-400倍的稀释），优选的，MOI=10E6，稀释培养基为类器官培养所用的培养基。