[发明专利]一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，包括如下步骤：（1）利用牛痘病毒加帽系统对原核生物总RNA进行加帽；（2）以莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶进行反转录；（3）向体系中加入含有3′末端含有3个单脱氧鸟嘌呤的特异性模板转换引物（TSO），与cDNA的胞嘧啶尾退火杂交，反转录以TSO为模板继续转录；（4）巢式PCR扩增，第一轮PCR引物为与TSO互补的外侧引物和GSP1，第二轮PCR引物为与TSO互补的内侧引物和GSP2。本发明为原核生物基因转录起始位点的鉴定提供了一种既简单又精确的方法。特别适用于低丰度转录本5′末端的快速、精确扩增。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法。

背景技术

cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术可用于快速获得转录本的5′末端序列。RACE技术从提出至今经过了不断的改进和完善。在传统RACE中，一个同聚物尾巴在末端转移酶(TDT)的存在下加到第一链cDNA的3′末端，从而作为锚定序列引发第二链cDNA的合成(Frohman,M.A.et al,1988；Ohara,O.et al,1989；Loh,E.Y.etal,1989)。传统RACE的主要缺点在于作为合成第二链的引物包含与同聚物尾巴互补的序列，容易产生非特异性扩增。

Edwards研究小组和Troutt研究小组分别提出了SLIC-PCR(Sequence-andligation-independent cloning PCR)和LA-PCR(ligation-anchored PCR)，这两种方法原理相似，都是基于T4 RNA连接酶将序列已知的锚头直接连在第一链cDNA的3′末端，然后用锚头中含有的部分序列和基因特异性引物(GSP)对cDNA进行扩增(Edwards,J.B.etal,1991；Troutt,A.B.et al,1992)。但是由于反转录提前终止产生的非特异性扩增比较严重。针对于此，Liu等人提出了RLM-RACE(RNA ligase-mediatedamplification of cDNAends)的方法，RLM-RACE用β消除法或烟草酸焦磷酸酶(TAP)去除mRNA的5′端帽子，然后在T4RNA连接酶的作用下连上一段序列已知的接头(Liu,X.et al,1993)。然而，这种方法仍存在缺陷，不完全的RNA也能连上接头从而造成非特性的扩增。

1996年Clontech公司推出了基于模板转换的CapFinder技术，当反转录进行到转录本的5′端帽子结构时，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MuLV)反转录酶表现出末端转移酶活性，在第一链cDNA3′末端加上3～4个胞嘧啶(Clontech,1996)。此时，在反应体系中加入3′末端含有多聚鸟嘌呤核苷酸(polyG)的特异性模板转换引物(TSO)，与cDNA 3′末端的胞嘧啶退火杂交，反转录酶会以TSO为模板继续向前转录，从而向cDNA3′末端引入了特异性序列，最后再进行PCR扩增。但是该方法依赖于RNA5′端的帽子结构，只适用于真核生物的转录本。

目前，针对于原核生物的转录本没有一个既简单又精确的5′RACE方法，RLM-RACE需要多部酶步骤并且特异性相对较低，而CapFinder技术只能用于真核生物。因此，本领域迫切需要开发一种应用于原核生物的简单、精确的5′RACE方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，方法简单，精确。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种原核生物cDNA5′末端快速扩增方法，包括下述步骤：利用NEB牛痘病毒加帽系统对原核生物的总RNA进行加帽处理，在5′三磷酸RNA的末端加上一个7-甲基鸟苷帽子结构，然后依照CapFinder的步骤，对目的基因的5′末端进行扩增。

以上所述的方法中，优选的，加帽后的步骤如下：