[发明专利]一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法

权利要求书

1. 一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，其特征在于，利用qRT-PCR检测成体公母鸡不同组织中Nanos2的表达情况，根据NCBI公布的鸡Nanos2序列设计引物，经PCR扩增出全长3411bp，构建过表达载体，同时根据PAM定位克隆的CDS序列，设计3个靶位点序列，并验证效率最高靶位点，构建Cas9/gRNA敲除载体，以DF-1为试验材料验证敲除活性；在体内、外两个水平对Nanos2进行过表达和敲除；体外分离纯化第2代的鸡ESCs，结合无饲养层RA体外诱导体系，分别转染过表达载体pcDNA3.0-Nanos2和敲除载体Nanos2-g1，并设置对照组，每隔2天观察ESCs的形态变化；在整个诱导过程中，收集各组第0、4和10d的ESCs，qRT-PCR检测相关基因表达变化；对诱导至4天和10天细胞进行间接免疫荧光检测标记蛋白CVH、ITGA6的表达情况；对诱导至第4天和第10天的细胞，分别标记CVH抗体和ITGA6抗体，经流式细胞分析检测不同处理组中阳性细胞率；体内验证，鸡胚正常发育至2.5天时，钝端以酒精消毒后开口，进行血管显微注射，至4.5天时观察鸡胚发育情况，在体式荧光倒置显微镜下观察荧光表达情况，对4.5日龄鸡胚石蜡切片进行PAS染色；分离出4.5d的生殖嵴和18d的睾丸组织，qRT-PCR检测目的基因Nanos2以及生殖相关基因cvh、c-kit、integrin α6的表达变化，同时，分离出PGCs和SSCs，以CVH和ITGA6抗体标记，通过流式细胞分析检测各组中阳性生殖细胞比例的变化。

2.根据权利要求1所述的一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，其特征在于，Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测：取成年公、母鸡不同组织：心、肝、脾、肺、肾、腺胃、肌胃、胰腺、十二指肠、盲肠、腿肌、性腺，检测Nanos2的相对表达量。

3.根据权利要求1所述的一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，其特征在于，Nanos2克隆与pcDNA3.0-Nanos2载体的构建：

针对NCBI提供的原鸡Nanos2编码区序列，设计特异性引物，通过PCR扩增出Nanos2的CDS区域，将片段克隆到Kpn I/EcoR I酶切的pcDNA3.0载体上；构建完成的pcDNA3.0-Nanos2通过酶切反应验证，并送往测序。