[发明专利]一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法

说明书

本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，包括Nanos2在鸡不同组织中的表达量检测、Nanos2克隆与pcDNA3.0‑Nanos2载体的构建、Nanos2敲除载体构建及敲除活性验证、体外Nanos2功能验证、体内Nanos2功能验证、Quantitative Real Time PCR(quantitative RT‑PCR)验证、细胞形态学观察及细胞免疫化学检测、流式细胞分析、石蜡切片及PAS染色。相对于现有技术，能够较快地在鸡生殖细胞水平完成Nanos2的功能验证。方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。该方法大大提高了体外诱导鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的效率。该方法大大提高了体内诱导鸡PGCs和SSCs的生成效率。

技术领域

本发明属于动物育种学和细胞生物学领域，具体涉及一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法。

背景技术

生殖细胞(Germ cells，GCs)是多细胞生物体内能够繁殖后代的一类细胞，具有将遗传信息传递至下一代的功能，因此开展生殖细胞的研究对于生命循环和传承具有重大的意义，其中，雄性生殖细胞更是在治疗男性不育方面具有突出的作用，且不涉及伦理和免疫排斥问题，故如何迅速开展诱导来源于其它组织的干细胞分化成为雄性生殖细胞的研究显得很有必要。

胚胎干细胞(Embryonic stem cells，ESCs)是早期胚胎或原始性腺中分离出来的一类细胞，具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。无论在体外还是体内环境，ESCs都能被诱导分化为机体几乎所有的细胞类型。在ESCs向雄性生殖细胞分化过程众多基因起到了共同的调控作用，其中包括BMPs、Nodal旁分泌因子的诱导作用、CD24联合RA激活的诱导作用，Blimp1作用于BMP信号下游调控作用，Prdm14等基因的表观遗传水平的变化，Nanog、Sox2、Oct4等多能性基因的维持作用等等。由于雄性生殖细胞发育过程十分复杂，涉及到雄性生殖细胞自身的发育分化以及微环境的共同作用，因此对ESCs向雄性生殖细胞发育机制的研究还不是完全清楚。

Nanos家族由三个成员构成，分别是Nanos1、Nanos2和Nanos3。Nanos家族成员均能够编码一个RNA结合蛋白，并且共享一个高度保守的锌指结构域。研究者认为Nanos对生殖细胞的分化是必不可少的。在小鼠中，Nanos2被发现小鼠SSCs的分化和维持具有重要的调控作用。同时，Nanos2能够促进雄性生殖细胞的分化，而抑制雌性生殖细胞的分化。这些表明Nanos2对于雄性生殖细胞的生成具有促进的作用。

为了阐明Nanos2在鸡雄性生殖细胞形成过程中的作用，我们结合现有的RA诱导体系和鸡胚注射体系，采用过表达和敲除的方法从体内和体外两个水平验证Nanos2的生物学功能。这为完善鸡ESCs体外诱导体系，提高鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的体外诱导效率鉴定基础。

但因其分化过程仍受到其他因素的影响，导致诱导效果不稳定，还需进一步完善该诱导体系。(1)鸡胚注射实验的效果取决于注射后的随机扩散程度；(2)分化过程仍受到其他未知因素的影响，导致诱导效果不稳定。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种Nanos2在鸡ESCs向雄性生殖细胞分化过程中功能验证的方法，本方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。运用该方法可以快速、高效的在短时间内完成Nanos2调控鸡ESCs向雄性生殖细胞分化的验证。