[发明专利]一种来自多能干细胞的神经嵴谱系周细胞及其诱导分化方法

说明书

本发明公开了一种来自多能干细胞的神经嵴谱系周细胞及其诱导分化方法，其是解离多能干细胞制备成单细胞悬液，接种在基质胶包被的孔板中，以NCN2培养基每天换液；培养一定时间后消化收集细胞；贴壁培养收集的细胞，并将培养液更换为周细胞诱导培养液，传代培养后检测周细胞的细胞表型，即得。本发明解决人脑血管周细胞来源受限及其他非限定诱导途径多能干细胞来源的周细胞异质性与混杂的缺点，获得的神经嵴谱系周细胞具有很强的维持血管稳定能力与收缩能力；标准化诱导分化程序可保证不同批次间获得的细胞群具有良好的一致性。

技术领域

本发明属于生物与医学领域，更具体地，本发明涉及一种来自多能干细胞的神经嵴谱系周细胞及其诱导分化方法。

背景技术

周细胞(pericytes)又称Rouget细胞或血管壁细胞，覆盖在微脉管内皮细胞的外面，存在于毛细血管、毛细血管后微静脉和毛细血管前微动脉。近年来周细胞的功能越来越受到关注，它在血管的形态发生和功能、心血管稳态以及缺血性中风、糖尿病视网膜病变等疾病中起到重要作用。但目前对周细胞并没有明确的定义，作为一种折衷方案，通常是综合位置、形态、基因/蛋白表达模式来判断。

周细胞在血管中无处不在，体内大约80％的微脉管有周细胞覆盖，他们嵌在与内皮细胞基底膜相连的血管基底膜中，但通常不在毛细淋巴管中。周细胞沿着内皮管表面伸展出胞质突。这些胞质突通常跨越几个内皮细胞，偶尔会与邻近的毛细管分支桥连。周细胞胞体一般在毛细管分枝点上，初级胞质突延伸到每个分支，形成一个Y字型。不同器官和血管床之间的周细胞密度不同，中枢神经系统(CNS)的血管系统通常被认为是周细胞覆盖最广泛的，内皮细胞和周细胞的比例为1-3:1，血管表面覆盖率大约30％，是血脑屏障(BBB)的重要组成部分。周细胞的分子标记目前不是很明确，而且他们的表达会随着发育状态、病理反应和体外培养出现动态变化，有一些已经验证的和经常使用的标记，比如PDGFR-β、NG2、CD13、αSMA和Desmin等。

不同部位的周细胞发育起源也不同。Quail-chick嵌合实验表明位于中枢神经系统前脑的周细胞发育于外胚层来源的神经嵴(neural crest,NC)，而覆盖在中脑、脑干和脊髓血管上的周细胞以及位于肠、肺、肝等体腔器官的壁细胞都是由中胚层-间皮发育而来。

脑血管周细胞不仅仅是血脑屏障的重要组成部分，在由内皮细胞、星形胶质细胞和神经元组成的神经血管单位(NVU)中也占据中心位置。周细胞接收来自临近细胞的信号，并进行编排和处理，从而发挥多种神经血管功能，包括对毛细血管血流动力学的调控、血脑屏障渗透性、对有毒代谢物的清除、血管生成以及干细胞活动，所有这些调控都是对正常大脑内稳态的维持是必要的。由于脑血管周细胞的功能多样性，近年来越来越多的研究关注脑周细胞在缺血性脑卒中的作用。

缺血性中风是一种缺血性脑血管病，病因是血管突然阻塞引起相关脑区的供血缺失，最终导致脑组织坏死。目前有效治疗缺血性中风的手段是相当有限的，主要是对闭塞的血管再通。由于周细胞在生理条件下起着重要的作用，在缺血性中风中介导着重要的病理进程，以周细胞为治疗靶点的治疗策略正逐渐兴起，例如直接移植周细胞。

为解决周细胞的来源与扩增的问题，不少研究致力于将胚胎干细胞(ES)及诱导多能干细胞(iPS)诱导分化为周细胞。据文献报道，2012年Ayelet Dar等人将hPSC制备成拟胚体，从自发分化的拟胚体中分离出CD105⁺CD90⁺CD73⁺CD31^-中胚层祖细胞，培养扩增这群细胞，他们表达周细胞标记物(CD146、NG2、PDGFR-β)，并且具有促进肢体缺血的血管和肌肉再生的功能。

2016年发表在Scientific Reports杂志上的一篇文章同样采用ES-拟胚体的方法，分化为间充质样细胞，文章中称这群细胞为血管周的祖细胞(PC-A)，PC-A具有成骨能力和维持血管生成能力。