[发明专利]寨卡病毒的qPCR检测方法

说明书

一种寨卡病毒的qPCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：针对寨卡病毒的NS5基因设计了一对引物，上游引物序列如SEQ NO:1所示，下游引物序列如SEQ NO:2所示；引物在ZIKV/Monkey/Uganda/MR766/1947株的靶序列被人工连接到pUC57载体上，形成标准品重组质粒；分别以标准品重组质粒和待测样品中的核酸为模板，进行qPCR扩增反应；反应后采集荧光信号，得到qPCR产物的Ct值并进行熔解曲线分析，当Ct值＜36且Tm值在86~87℃之间时，样品中含有鸭坦布苏病毒，为阳性；建立标准曲线，得待测样品含量。本发明方法可以检测非洲型和亚洲型的寨卡病毒，灵敏性高，特异性好。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种寨卡病毒的qPCR检测方法以及引物，该检测方法能够定量检测寨卡病毒。

背景技术

寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）是一种主要经伊蚊特别是埃及伊蚊叮咬传播的黄病毒，核酸为单股负链RNA。1947年，通过一个黄热病监测网络在乌干达的恒河猴中首次分离发现该病毒，并于1952年在乌干达和坦桑尼亚联合共和国确认可以感染人类。此后，在亚非大陆共发现14例散布的人类感染发病，伴随轻微病症。2007年南太平洋的密克罗尼西亚联邦雅浦岛出现由寨卡病毒感染引起的第一次大规模疫情，确诊49个病例。2013~2014年间，法属波利尼西亚发生寨卡病毒暴发，约11%当地居民被感染，大约有2.8万例病例报告，其中70例为重症病例｡此后，在南太平洋的新喀里多尼亚、库克群岛、复活节岛和瓦努阿图等地都有小规模疫情。2015年，南美发生寨卡病毒感染大规模爆发并向全球蔓延，并报道与吉兰–巴雷综合征及新生儿先天小头畸形（小头症）之间存在关联。根据包膜蛋白或非结构蛋白NS5序列差异，可将寨卡病毒分为亚洲型和非洲型，2015后美洲流行的毒株为亚洲型。到2017年5月，我国已有25例输入性寨卡病毒感染病例。

从2007年雅浦岛寨卡疫情爆发至今，国内外多个机构建立了寨卡病毒的巢式PCR或qPCR检测方法，主要针对病毒较为保守的非结构蛋白基因。本发明的发明人对其中一些公布的qPCR引物进行了初步评估分析。2013年，德国的Faye O等针对NS5建立了探针法qPCR，引物和探针均使用了简并碱基，能检测到0.05 PFU/reaction病毒RNA，并不与登革热、黄热、西尼罗热等31株病毒交叉反应，但是以这些病毒为模板时会有Ct值，表明引物的二聚体比较严重。2016年，巴西圣保罗大学的Pessôa R等针对NS5建立了染料法qPCR，在77个疑似病例中通过该法检测到31个寨卡病毒阳性，不过上下游引物与很多毒株核酸存在多个碱基错配。2016年，中科院武汉病毒所Xu MY等从萨摩亚入境深圳的患者血清中成功分离一株寨卡病毒，并针对NS5-3’UTR建立了染料法qPCR，但是上下游引物与目前大多数已公布序列均有1个碱基以上错配。2016年，第二军医大学郑夔等针对NS2a建立了探针法qPCR，能检测到1 PFU/mL的病毒RNA和150 copies/μL体外转录RNA，但是上下游引物与很多毒株核酸有2个碱基以上错配。

发明内容

本发明旨在提供一种寨卡病毒的qPCR检测方法以及引物，本发明的检测方法具有很高的灵敏性和很好的特异性。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种寨卡病毒的引物对，其中一条引物ZIKV-F为针对寨卡病毒的NS5基因设计的上游引物，该上游引物的序列为5’-GCCGCCACCAAGATGAACTGAT-3’ （如SEQ NO:1所示）；另一条引物ZIKV-R为针对寨卡病毒的NS5基因设计的下游引物，该下游引物的序列为5’-GGTCGTTCTCCTCAATCCACACTC-3’ （如SEQNO:2所示）。

为达到上述目的，本发明采用的一种寨卡病毒的qPCR检测方法的技术方案是：包括以下步骤：