[发明专利]一种快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组及试剂盒

权利要求书

1.一种快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于，所述多重RT-PCR检测引物组由PEDV RT-PCR检测引物、PDCoV RT-PCR检测引物和PReoV RT-PCR检测引物组成；

所述PEDV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:1 所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:2 所示核苷酸序列的下游引物组成；

所述PDCoV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:4 所示核苷酸序列的下游引物组成；

所述PReoV RT-PCR检测引物由具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID NO:6 所示核苷酸序列的下游引物组成。

2.根据权利要求1所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于，所述PEDV RT-PCR检测引物是依据PEDV的N基因进行设计，扩增目的片段大小为458bp；所述PDCoV RT-PCR检测引物是依据PDCoV的N基因进行设计，扩增目的片段大小为627bp； 所述PReoV RT-PCR检测引物是PReoV的S2基因进行设计，扩增目的片段大小为974bp。

3.根据权利要求1所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测引物组，其特征在于，所述多重RT-PCR检测引物组在制备猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病毒和猪呼肠孤病毒鉴别检测试剂盒的应用。

4.一种如权利要求1所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重RT-PCR检测试剂盒包括具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的上游引物以及具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示核苷酸序列的下游引物。

5.根据权利要求4所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重RT-PCR检测试剂盒中，包括RT反应体系和PCR反应体系；所述RT反应体系为：采用20 µL体系，RNA 模板14 µL，5×PrimeScript TM缓冲液4 µL，RT Enzyme Mix 1.0µL，反转录引物Oligo18T 1.0 µL；所述PCR反应体系为：采用25 µL体系，灭菌水6.5 µL，PrimeSTAR HR 12.5 µL，25 µmol/L PEDV、 PDCoV和PReoV上下游引物各0.5 µL，模板3.0 µL。

6.根据权利要求5所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的多重RT-PCR检测试剂盒中RT反应条件为：37℃ 20 min，85℃ 30 s，12℃保存；PCR反应条件为：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，55.6℃复性5 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

7.根据权利要求5所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重RT-PCR检测试剂盒的最佳退火温度为55.6℃。

8.根据权利要求4或5所述快速区分PEDV、PDCoV和PReoV的多重RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR检测试剂盒的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO: 6所示引物使用浓度为25 μmol/L。