[发明专利]一种肿瘤干细胞的分离检测方法

权利要求书

1.一种肿瘤干细胞的分离检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S1、样本的制备：首先将取样的肿瘤细胞加入试管中，然后向试管中加入一号消化酶液，可将取样的肿瘤细胞消化至单个细胞，然后对样本进行离心和沉淀，再对沉淀的细胞进行收集，即可得到样本细胞；

S2、消化酶状态模拟：将S1中收集的样本细胞中加入二号消化酶液，并在20～36℃孵育1～10h，从而实现模拟消化酶的应激状态，之后将孵育后的细胞移至1～18℃条件下继续孵育10～72h，即可实现模拟低温和消化酶应激状态；

S3、无血清和低氧状态模拟：将S2中孵育后的细胞分别经洗涤、离心和沉淀后，得到的细胞加入不含血清或血清低于6％的细胞培养液，均匀混合，在密闭条件下，在20～36℃下孵育25～65h，即可实现模拟无血清和低氧应激状态；

S4、肿瘤细胞的分离：将S3中孵育后的细胞离心和沉淀收集的细胞，加入含5～15％FBS的细胞培养液，均匀混合，之后将细胞接种到细胞培养皿中进行贴壁生长，细胞贴壁后换肿瘤干细胞TSC培养基进行培养，当细胞长满后，重复S1-S4步骤即可得到肿瘤细胞；

S5、肿瘤干细胞的检测筛选：将S4述获得的肿瘤细胞接种到细胞培养皿中，采用TSC培养基，并向TSC培养基中加入Hoechst33342荧光染料，使荧光染料穿透细胞膜与DNA结合，即可实现将肿瘤细胞的细胞核进行染色，染成蓝色，然后使肿瘤细胞进行单细胞低密度贴壁生长，之后检测人员使用荧光显微镜对TSC培养基内的培养细胞进行检测，肿瘤细胞染上色深，肿瘤干细胞染上色少，再通过流式细胞仪将肿瘤干细胞分离出来，即可得到肿瘤干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种肿瘤干细胞的分离检测方法，其特征在于：所述步骤S5中的Hoechst33342是一种脂溶性的蓝色荧光染料，可以穿透细胞膜与DNA结合，常用于细胞调亡的检测，也用于普通的细胞核染色或常规DNA染色。

3.根据权利要求1所述的一种肿瘤干细胞的分离检测方法，其特征在于：所述所有细胞培养液根据不同种类肿瘤细胞选择不同的细胞基础培养基。

4.根据权利要求1所述的一种肿瘤干细胞的分离检测方法，其特征在于：所述步骤S1中一号消化酶液中的消化酶为胰蛋白酶，且步骤S2中的二号消化酶液为0.1～3U/ml的Dispase分散酶液。