[发明专利]核苷酸类似物以及筛选DNA聚合酶的方法

说明书

本发明提出了一种核苷酸类似物。该核苷酸类似物具有下列结构，其中，L表示可切割连接基团；Label表示第一可检测标记；P表示三磷酸基团；Base表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。根据本发明实施例的所述核苷酸类似物可有效用于筛选具有催化3’‑OH端带有可逆终止子(MRT)的三磷酸核苷酸发生聚合反应的活性并可用于SBS的聚合酶。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及核苷酸类似物以及筛选DNA聚合酶的方法。

背景技术

随着人类基因组的成功解码，基因测序技术应用越来越广泛，其中边合成边测序(SBS)，因其高通量、价格低而倍受青睐。SBS测序技术是利用聚合酶将每个用荧光标记的核苷酸引入到DNA引物中，然后测定来自核苷酸的荧光信号以鉴别该核苷酸的碱基并可同时分析其互补碱基。但是，因用于SBS的三磷酸核苷基本上为双修饰的可逆终止子(DRT)，这些双修饰的可逆终止子是在三磷酸核苷的3’-OH部分具有可逆的阻断基团以及在碱基上具有荧光基团修饰的三磷酸核苷，这种双修饰的方式无法将荧光基团连接到碱基上的连接键在测序后完全除去，因而留下所谓的分子疤，随着测序的进行，新聚合的链包含有更多的分子疤，最终分子疤的积累降低了聚合酶的活性和保真度，导致所测序的碱基数目受到限制。

单修饰可逆终止子(MRT)是在3’-OH基团上的，该可逆阻断基团起到双重作用，既作为荧光信号的报道子又作为可逆终止子，该修饰方式可以成功的避免采用DRT修饰时在SBS中所产生的分子疤，从而降低对聚合酶的影响，以提高测序的读长。

但是自然条件下选育出来的常规DNA聚合酶并不能利用MRT修饰的三磷酸核苷酸进行有效的聚合反应，为了能使MRT修饰的三磷酸核苷广泛地应用于SBS测序技术中，需要对聚合酶进行适当的人工修饰或改造。另外，也可以减小修饰后的三磷酸核苷酸的大小，以利于酶的聚合反应。

但目前对能利用MRT技术的DNA聚合酶，缺失直接、快速、有效的筛选体系和利用体系。

发明内容

本申请旨在至少在一定程度上解决现有技术的技术问题之一：

本发明提出了一种利用荧光共振能量转移(FRET)技术体外高通量筛选DNA聚合酶的方法，该DNA聚合酶能催化作为可逆终止子(MRT)的、3’-OH端带有生物素(Biotin)阻断基团的三磷酸核苷进行聚合反应并可应用于SBS。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种核苷酸类似物。根据本发明的实施例，所述核苷酸类似物具有下列结构，

其中，L表示可切除连接基团；Label表示第一可检测标记；P表示三磷酸基团；Base表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。其中，L和Lable构成单修饰可逆终止子(MRT)。根据本发明的实施例，通过检测核苷酸类似物中的第一可检测标记在聚合反应中的变化，可准确确定待筛选聚合酶是否具有聚合活性。根据本发明实施例的所述核苷酸类似物可有效用于筛选具有催化3’-OH端带有可逆终止子(MRT)的三磷酸核苷酸发生聚合反应的活性并可用于SBS的聚合酶。