[发明专利]引物、cDNA、载体、AQP4单克隆抗体及制备方法

说明书

本发明属于DNA重组技术领域，公开了一种引物、编码的cDNA、载体、AQP4单克隆抗体及制备方法，建立表达大鼠AQP4 m23的cho‑cell克隆；用引物逆转录聚合酶链反应，从大鼠大脑中提取的总RNA中克隆了一种编码大鼠AQP4 m23的cDNA；在测序后，cDNA被插入到一个perres 2‑egfp载体的NheI及SacII位点中。本发明所制备的抗鼠AQP4及抗人AQP4在小鼠中具有对中枢神经系统中AQP4的高亲和力，并已证明可在体及体外诱发小鼠产生类视神经脊髓炎病变及症状。这有利于视神经脊髓炎的研究及新治疗方法探索。

技术领域

本发明属于DNA重组技术领域，尤其涉及一种引物、编码的cDNA、载体、AQP4单克隆抗体及制备方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：抗原小鼠体内免疫法：利用现成的抗原或合成多肽作为抗原，注射至小鼠体内，通过诱发小鼠的免疫反应而获得抗体，并最终进行抗体提纯。噬菌体抗体技术：将某种动物的所有可变区基因克隆在噬菌体表面进行展示表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而得到特异性抗体。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)根据文献，通过抗原免疫法无法诱导小鼠体内产生抗水通道蛋白4(抗AQP4)的有效抗体，即产生的抗体无致病性作用，因此无法应用于视神经脊髓炎的模型建立。

(2)由于噬菌体抗体技术所需要的抗原仅可以通过多肽合成的方式获得，并不具有蛋白的空间折叠结构，因此筛选出来的抗体无法做到与体内受体进行良好的结合，因而亲和力及致病性均大大降低。

(3)目前市面上的抗水通道蛋白4抗体(抗AQP4抗体)均是用于对水通道蛋白4(AQP4)的检测，然而并不具备使动物致病的作用，因此无法用于疾病模型的建立。

解决上述技术问题的难度和意义：

难度：由于通过抗原免疫法无法诱导小鼠体内产生抗水通道蛋白4(抗AQP4)的有效抗体。因此，要获得可在小鼠体内致病的抗AQP4抗体，需筛选出对鼠AQP4具有高亲和力及致病性的抗体。在上述技术中，由于采用的抗原均为完整的AQP4蛋白，而通过免疫诱导出的抗体并不能完全适应该抗原的空间结构，且抗体组成不可控，因此制备的抗体不具有高亲和力及致病性。

而在本设计中，通过直接针对大鼠AQP4m23进行单克隆抗体制备，可获得在体外实验中具有致病性的抗鼠AQP4单抗。

意义：抗AQP4抗体是视神经脊髓炎的主要致病因子。视神经脊髓炎是一种高致病性，高致残性，高复发率的疾病。目前成熟的视神经脊髓炎的治疗方法仍无法完全治愈及预防发作。因此，对于视神经脊髓炎发病机制及治疗方案均需有深入研究。

目前建立视神经脊髓炎的动物模型仍然是十分困难的。本设计中的抗鼠AQP4单抗有助于建立视神经脊髓炎的大鼠模型，对于视神经脊髓炎的研究具有积极意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种引物、编码的cDNA、载体、AQP4单克隆抗体及制备方法。

本发明是这样实现的，一种引物，所述引物的序列为SEQ ID NO：1。

本发明的另一目的在于提供一种使用所述引物编码的大鼠AQP4m23cDNA。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述大鼠AQP4m23cDNA的perres2-egfp载体，其特征在于，所述大鼠AQP4m23cDNA插入到perres 2-egfp载体的NheI及SacII位点中。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述perres 2-egfp载体表达大鼠AQP4的CHO细胞克隆。