[发明专利]一种热稳定性壳聚糖酶的制备方法

权利要求书

1.一种热稳定性壳聚糖酶的制备方法，其特征在于按照以下步骤进行：

一、高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶基因的克隆；

1、壳聚糖酶部分序列的获得：设计简并性引物，上游引物BmCsn-partialF为5’-GAAAGCGATGACATMAGCAA-3’，SEQ ID NO.1，下游引物BmCsn-partialR为5’-ACACGGGCAACHGATTCTCTCC-3’，SEQ ID NO.2，获得B.mojavensis壳聚糖酶的部分序列BmCsn-partial，SEQ ID NO.3；

2、染色体步移法获得BmCsn的全长序列信息

染色体步移法的具体步骤如下：

5’未知序列的获取：根据BmCsn基因的已知序列设计3条高退火温度的特异性下游引物

SP1：5’-ACTGCGTCTTGAGCAGCGCGGAATTCC-3’，SEQ ID NO.4、

SP2：5’-TATCATTTCCAAGCGACTCCCAGGCGG-3’，SEQ ID NO.5、

SP3：5’-TGCTGATGTCATCGCTTTCTTCTTCGG-3’，SEQ ID NO.6，

同时使用试剂盒中低退火温度的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4中的一种，利用特异性引物与简并引物之间退火温度的差异进行热不对称PCR，通过三次巢式PCR获取壳聚糖酶BmCsn的5’侧翼序列；

3’未知序列的获取：根据BmCsn基因的已知序列设计3条高退火温度的特异性上游引物

SP4：5’-ATGAGAAGAAATGGTTACATGAATTC-3’，SEQ ID NO.7、

SP5：5’-ATGACGACCTGATGAATCCGGCAGATCC-3’，SEQ ID NO.8、

SP6：5’-ACACCCGTGATGAGTGGAGAGAATCGG-3’，SEQ ID NO.9，

同时使用试剂盒中低退火温度的简并引物AP1、AP2、AP3、AP4中的一种，利用特异性引物与简并引物之间退火温度的差异进行热不对称PCR，通过三次巢式PCR获取壳聚糖酶BmCsn的3’侧翼序列；

根据获得的壳聚糖酶基因的部分序列、5’侧翼序列和3’侧翼序列拼接后获得壳聚糖酶基因BmCsn的全长基因序列，SEQ ID NO.10；

根据得到的B.mojavensis壳聚糖酶的开放阅读框序列信息，设计特异性引物,上游引物BmCsn-BamHI-F为5’-AAGGATCCATGAAAATCAGTTTGAAG-3’，SEQ ID NO.11，下游引物BmCsn-XhoI-R为5’-AACTCGAGATTGATTACAAAATTAC-3’，SEQ ID NO.12，以B.mojavensis的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得一段长约837bp的片段，连接pEASY-T1后，经序列测定验证为B.mojavensis的壳聚糖酶基因，并命名为BmCsn，获得的重组质粒命名为T-BmCsn；

二、含高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶工程菌的构建和酶活鉴定；

1、含高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶基因表达载体的构建

利用限制性内切酶BamHI和XhoI双酶切T-BmCsn获得BmCsn的酶切片段，与经同样双酶切的质粒载体pET28a(+)连接，验证正确的重组载体命名为pET28a-BmCns，该基因的反向引物BmCsn-XhoI-R中不含有终止密码子，因此后续诱导的重组BmCsn蛋白的C-末端带有6个组氨酸标签；

2、含高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶工程菌的构建

将获得的重组质粒pET28a-BmCns热激转化大肠杆菌BL21，获得含高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶工程菌BL21-BmCsn。

三、高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶BmCsn的制备方法：

1、培养基配制

(1)固体保藏培养基：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，卡那霉素50mg/L，琼脂20g/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

(2)液体种子培养基：酵母浸粉1-10g/L，蛋白胨5-10g/L，NaCl 1-5g/L，卡那霉素50mg/L，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

(3)发酵培养基：葡萄糖20，酵母浸粉10、蛋白胨20，MgSO₄ 40.5、NaCl 2.5、KH₂PO4 2、CaCl 20.1，pH 6.5，121℃高压蒸汽灭菌20min；

2、菌株活化：挑取菌种划线接种至固体保藏培养基，于恒温培养箱37℃培养14～20h；

3、液体种子制备：挑取活化菌株接种于装有种子培养基的三角瓶中，纱布封口，于37℃，160～200r/min摇床振荡培养12～24h，得液体种子；

4、液体发酵：按5～10％接种量向发酵培养基接入液体种子，转速200r/min，pH7.0，菌液在37℃培养2-3小时，至OD₆₀₀≈0.3-0.5时加入乳糖0.1-0.5％诱导，乳糖诱导后降温至25-30℃，发酵时间12-20小时，结束后再以6000rpm转速离心10min，得到含壳聚糖酶的湿菌体。