[发明专利]一种热稳定性壳聚糖酶的制备方法

说明书

本发明公开了一种热稳定性壳聚糖酶的制备方法，包括高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶基因的克隆，含高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶工程菌的构建，高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶BmCsn的制备。本发明的壳聚糖酶具有明显的稳定性，28℃保温7天，酶的活性仅较最初活性降低5％。高于已报道一般产品的稳定性。本发明的壳聚糖酶进行的发酵条件的优化，其蛋白量高达4.5g/L。本发明中的壳聚糖酶经高密度发酵后，其酶活高达834U/mL发酵液。

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，涉及一种热稳定性壳聚糖酶的制备方法。

背景技术

壳寡糖是目前自然界中发现的唯一一种碱性氨基寡聚糖，是一种动物性纤维素。由于其可溶性好，具有较强的阴离子交换能力，以及高的生物活性，壳寡糖已经被广泛应用于医药、食品、农业、化工等领域。而目前壳寡糖的制备主要有物理、化学和生物方法。物理方法简单易操作，但是很难控制特定分子量的壳寡糖的生产，原材料浪费严重。化学法反应迅速，但是反应条件苛刻，成本高，对环境的污染不容忽视。相对而言，生物法简单，无需额外的药品添加，反应条件和成本低。生物法的关键就是利用壳聚糖酶特异催化壳聚糖β-1,4-糖苷键的活性，反应过程温和，成本低，无单糖的产生。

目前已经在很多微生物中分离纯化到壳聚糖酶，其酶学性质和发酵条件的优化也取得了很大的进展。但是由于产酶菌株产酶量及酶活性普遍较低，难以规模化生产和广泛应用。因此继续筛选酶活性高，并通过基因工程的方法提高产酶量是充分发挥壳聚糖酶在壳寡糖工业生产中应用的关键。本发明从本实验室筛选到的一株具有高壳聚糖酶活性的菌株中克隆到了一个壳聚糖酶基因，该酶反应条件温和，常温酶活持久，本发明运用基因工程手段实现了该壳聚糖酶的高效稳定表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种热稳定性壳聚糖酶的制备方法。本发明方法如下步骤：

一、高催化活性，常温酶活性持久的壳聚糖酶基因的克隆。

1、壳聚糖酶BmCsn部分序列的获得

具有高壳聚糖酶催化活性的菌株来自于烟台海岸带沙质土壤中，菌株分类鉴定为Bacillus mojavensis，该菌株已经收藏于中国工业微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.7187。由于B.mojavensis的基因组序列尚未公布，利用同样来自于芽孢杆菌属其它壳聚糖酶的序列比对设计简并性引物，上游引物BmCsn-partialF为5’-GAAAGCGATGACATA(C)AGCAA-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物BmCsn-partialR为5’-ACACGGGCAACA(T/C)GATTCTCTCC-3’(SEQID NO.2)，获得B.mojavensis壳聚糖酶的部分序列BmCsn-partial(SEQ ID NO.3)。测序结果显示该部分序列为壳聚糖酶BmCsn的部分序列，序列信息如下：

gaaagcgatgacatcagcaatctcaagggattcgcttccgcctgggagtcgcttggaaatgataaggaattccgcgctgctcaagacgcagtaaatgacagcttgtattatcagcctgccatgaaacgatccgatcatgccggactgaaaacggcactggcaagagctgtgatgtacgatacagttattcagcatggcgatggtgatgaccccgactccttttatgccttgatcaaacgcacgaacaaaaaagcgggcggttcacctaaagacggaattgatgagaagaaatggttacatgaattcttggatgtgcgatatgacgacctgatgaatccggcagatcctgacacccgtgatgagtggagagaatc

2、染色体步移法获得BmCsn的全长序列信息

染色体步移法的具体步骤如下：