[发明专利]含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法

权利要求书

1.含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体，其特征在于，所述重组载体的构建方法如下：

1)根据从驯鹿的基因组上注释出的NADPH-细胞色素P450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的NADPH-细胞色素P450还原酶基因序列，用以作为对照；

2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊NADPH-细胞色素P450还原酶基因分别构建于大肠杆菌表达载体pET-28a，获得重组载体。

2.含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体的编码蛋白表达、分离纯化方法，其特征在于，将重组载体分别转化入大肠杆菌高效表达菌株BL21中，在2YT培养基中培养，经过IPTG诱导表达，获得菌体，收集菌体，高压破碎，之后过镍离子柱纯化，得到NADPH-细胞色素P450还原酶蛋白。

3.根据权利要2所述含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，

转化操作具体为：提取阳性克隆质粒200ng，与50μL商业大肠杆菌感受态BL21混合均匀，冰上孵育30min，然后42℃热击45S，再在冰上放置2min，然后加入300uL的LB培养基，37℃复苏1h，后涂布于有卡那霉素抗性的LB固体平板培养基中，过夜培养，挑取单克隆验证，阳性克隆留取备用。

4.根据权利要2所述含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体编码蛋白的表达、分离纯化方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)种子液培养：挑取包含目的质粒的BL21菌株，接种于含5mL LB液体培养基的小试管中，37℃、220rpm过夜培养，作为种子液；

2)转接：将种子液按1％接种量转入800mL 2YT液体培养基中，37℃、220rpm，摇床培养4-6h至OD 600约为0.6-0.8；

3)诱导：降低摇床温度至16℃，待培养的菌液温度降低后，加入异丙基硫代半乳糖苷至终浓度0.5mM，诱导表达14-16h；

4)收菌：表达完成后，将上述培养菌液收集到瓶中，将离心机预冷到4℃，6000rpm，离心30min；

5)清洗：去除上清液，加入30mL蛋白缓冲液，用旋涡振荡器重悬菌体，将重悬的菌体再次离心6000rpm，10min，倒掉上清，加入30mL蛋白缓冲液，用旋涡振荡器将菌体重悬，倒入50mL离心管中，-80℃冰箱保存；

6)破菌：将上述收集好的菌液采用高压低温破碎仪在压力1200bar，4℃条件下进行破菌3-4次，使细胞充分裂解，从而将表达的目的蛋白释放并溶于蛋白缓冲液中；

7)离心：将破碎好的菌液于预冷好4℃的离心机中8000rpm，离心50min，取离心后的沉淀、上清，制样，并收集上清液；

8)纯化及浓缩：上清液经0.45μm微孔滤膜抽滤，进行镍亲和层析纯化，具体步骤如下：

(1)柱平衡：先用蒸馏水洗2个柱体积，再用20mM咪唑蛋白缓冲液平衡Ni亲和层析柱1个柱体积；

(2)上样：将上清液按0.5mL/min流速缓慢经过Ni亲和层析柱，再重复一次；

(3)洗脱杂蛋白：采用蛋白缓冲液冲洗1个柱体积，再用50mL含50mM咪唑的蛋白缓冲液去洗脱结合较强的杂蛋白，取前几滴流穿样品，制样；

(4)洗脱目的蛋白：分别用20mL含100mM、200mM和300mM咪唑蛋白缓冲液将目的蛋白洗脱下来，分别取前几滴流穿样品，制样，12％SDS-PAGE检测；

(5)浓缩换液：将收集到的目的蛋白用50mL Amicon超滤管离心浓缩，浓缩至1mL，再加10mL蛋白缓冲液，再浓缩至1mL，重复该过程1次，确保除去蛋白中的咪唑，得到纯化的目的蛋白。