[发明专利]含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体构建及表达、分离纯化方法

说明书

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及含驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因的重组载体及表达、分离纯化和活性测定的方法：1)根据从驯鹿的基因组上注释出的NADPH‑细胞色素P450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因序列，同理得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的NADPH‑细胞色素P450还原酶基因序列，用以作为对照；2)利用设计的引物，通过gibson连接方法，将优化后的驯鹿、狍子和羊25羟基维生素D‑1α羟化酶基因分别构建于大肠杆菌表达载体pET‑28a，获得重组载体。含驯鹿NADPH‑细胞色素P450还原酶基因的菌株表达获得酶的催化活性是羊的20倍，是狍子的5倍。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。

背景技术

NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450reductase，CPR)是一种以FAD和FMN作为辅基的细胞微粒体复合黄素蛋白，可以催化氧化型细胞色素C生成还原型细胞色素C(见附图1)，在人体主要分布于肝脏，分子量约78KD，是肝微粒体混合功能氧化酶-细胞色素P450酶系的重要组分。细胞色素P450(cytochrome P450或CYP450，简称CYP450)代表着一个很大的可自身氧化的亚铁血红素蛋白家族，属于单氧酶的一类，因其在450纳米有特异吸收峰而得名。因其在内源性(如类固醇、类花生酸物质和脂肪酸)和外源性的化学物质(包括药物、植物毒素、致癌物质和环境污染物等)尤其在昆虫对杀虫剂的抗性机制以及选择毒性中，昆虫对寄主植物的适应性等方面和环境有害化学物质的氧化代谢方面起着重要的作用，而受到广泛的重视。此外，推测它能导致线粒体功能紊乱、细胞凋亡，还可能参与了一些疾病的发生，比如帕金森综合症。

现今，NADPH-细胞色素P450还原酶的研究也逐渐受到生物医学领域的重视。CPR是哺乳动物体内具有重要生理作用的辅酶，它不但是细胞色素P450、血红素加氧酶和角鲨烯单加氧酶的电子供体，而且还能为7-胆固醇脱氢酶还原酶、细胞色素b5以及其他催化固醇合成、脂肪酸去饱和及延伸途径的酶蛋白提供电子。它可以催化底物的单电子还原，使带有不配对电子的底物自由基与分子氧结合，产生活性氧，这就是黄素蛋白酶催化的氧化还原循环。在这一循环中需要消耗NADPH，其氧化速率可以反映细胞色素P-450重组酶系对底物的代谢情况。另外，在肿瘤细胞中转入CPR基因，有助于提高抗肿瘤药物的药物细胞毒作用。CPR不仅对某些有害物质有一定的代谢作用，而且是细胞色素P450酶系电子传递链上一个关键的酶。

总之，作为机体代谢系统的一个重要酶类，对NADPH-细胞色素P450还原酶的研究一方面可以在一定程度上解决耐药性的问题，因其对某些有害物质的代谢作用，也可用于疾病的防御与治疗等有助于对药物代谢途径的正确分析，包括诱导、抑制，以及药物之间的相互作用；另一方面，作为重要的供氢酶，在生物转化工程、肿瘤治疗及生物制氢研究中CPR也将发挥重要作用，甚至意义还远不止如此。驯鹿的NADPH-细胞色素P450还原酶催化活性比较高，然目前为止并未见报道。

本发明旨在提供一种涉及含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。

发明内容

本发明旨在提供一种涉及含驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶基因的重组载体及编码蛋白表达、分离纯化和活性测定的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案如下：

1)根据从驯鹿的基因组上注释出的NADPH-细胞色素P450还原酶基因和大肠杆菌密码子偏好性，得到优化后的驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶核酸序列，同时，得到根据大肠杆菌密码子偏好性优化后的狍子和羊的NADPH-细胞色素P450还原酶，用以作为驯鹿NADPH-细胞色素P450还原酶的对照；