[发明专利]基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒及应用，该分型检测试剂盒包括a）降解mRNA建库试剂、引物及磁珠模块；b）文库定量试剂模块；c）上机测序试剂模块；所述的引物包括Bio‑B‑TVN引物、Primer‑A随机引物、Primer‑A引物、Primer‑B引物，磁珠为包被有链霉素的磁性珠粒，Bio‑B‑TVN引物上的生物素可与磁珠包被的链霉素相结合。本发明通过3’端测序的方式使得获取的mRNA即便有部分降解亦可对样本的整个转录组进行精确定量。通过传统应用乳腺癌FFPE样本表达谱分析的微阵列及个别基因表达定量的荧光定量手段不能实现十分精准的分析，而通过3’末端测序的方法可以达到精确定量的目的。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于检测FFPE样本乳腺癌基因表达谱对乳腺癌进行分子分型的检测试剂盒及应用。

背景技术

目前乳腺癌在临床仍以患者年龄、原发瘤大小、临床分期、组织学分级、腋窝淋巴结转移和激素受体状态等指标，预测乳腺癌预后和指导选择治疗方案。但乳腺癌个体差异性较显著，上述标准无法进一步精确地预测预后，难以满足乳腺癌治疗方案“个体化”。比较分析乳腺正常组织和肿瘤的基因表达谱，可以明确mRNA水平的基因表达差异，从而根据基因表达情况预测患者的临床转归，采取相应诊疗措施。基于基因表达谱的各种乳腺癌标签表现出更加客观、准确的预后预测能力，具有良好的发展前景。

自20世纪90年代中期基因芯片的出现，便被广泛用于癌症相关的基因表达谱分析，并用于预测人类癌症中复杂多样的生物学特征和临床特征。虽然基因表达谱分析被广泛应用于人类癌症的研究中，但在患者的临床治疗方面的应用却受到很大的局限。这是由于目前所获得的大部分临床病例肿瘤样本都是通过甲醛固定或石蜡包埋的方式储存，而很少通过低温冻存的方式保存。为了尝试利用这些丰富的肿瘤样本，研究者尝试通过RT-PCR或DASL等方式进行表达量的分析，但这些方法并不能够进行精确的定量，且只能对少数的已知转录本进行定量。

近些年，随着二代测序的出现以及测序成本的不断下降，可以通过二代测序的方式分析FFPE样本中mRNA的表达水平，从而克服微阵列技术对于FFPE样本检测的限制，并对功能基因组学产生革命性的影响。

传统的mRNA测序技术是通过oligo dT反转录引物将mRNA反转录成cDNA，然后打断建库或是通过将带有oligo dA尾的mRNA富集下来然后打断、逆转录、建库。这两个方法都需要获得高质量的RNA得以实现。

发明内容

有鉴于现有的关于乳腺癌的mRNA测序及定量手段主要是用新鲜组织进行的转录组测序，对于样本有较高的要求，无法适应临床诊断的需要。本发明的目的是提供一种不需要质量较好的mRNA，即便降解样本也可以得到较优结果的基于illumina平台的乳腺癌分型检测试剂盒。

本发明的另一个目的是针对现有临床诊断上的不足，提供了一种新的可用于乳腺癌分型的方法，通过高通量测序手段可以对乳腺癌患者的临床FFPE样本的mRNA进行的精确定量，从而通过对乳腺癌的表达谱分析癌症患者所患肿瘤的病理进程，进而为临床治疗提供更加精确的癌症分型手段及诊疗手段，同时也可为癌症研究的专家及学者在乳腺癌表达谱上的研究提供更加广泛的材料来源和分析数据。检测方法具体步骤为：(a)通过切片机切下20μm厚度的切片3张，然后通过二甲苯和酒精脱蜡(b)Recover All total Nucleic Acid组织切片试剂盒提取总RNA(d)通过SuperscriptⅡ逆转录酶(invitrogne)和带有生物素的、P5接头及oligo dT的引物将mRNA逆转录成带有接头序列的cDNA，随后合成cDNA的第二条链以及文库构建。(e)通过Ampure XP磁珠纯化二链合成产物。(f)通过带有index的扩增引物对文库进行扩增(g)扩增文库上机测序(h)下机数据质量控制reads过滤、align、mapping和定量。