[发明专利]检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法，具体地，本发明提供了检测NSCLC患者血液游离核酸EGFR基因19外显子突变的方法、引物、探针及其试剂盒，具有过程简单、可检突变类型多、绝对定量、灵敏度高、样本易获取等优点。

技术领域

本发明属于生物技术和肿瘤诊断领域，具体地说，本发明涉及检测非小细胞肺癌EGFR基因突变的试剂盒及方法。

背景技术

肺癌的发病率和死亡率均居世界首位，其中，非小细胞肺癌(NSCLC)占85％以上，而大部分患者在确诊时已处于癌症晚期，其死亡率高达80％-90％。因此，晚期NSCLC的治疗越来越受到人们重视。含铂双药联合化疗仍是晚期NSCLC治疗的主要手段，但治疗效果并不十分理想。随着肿瘤分子生物学技术的发展，药物靶向治疗效果较为显著，相对传统细胞毒性药物，靶向治疗可以更加精准地作用于肿瘤部位，能明显减少对周围正常组织的损伤，在降低患者不良反应发生率的同时，提高作用于肿瘤的准确性。

表皮生长因子受体(EGFR)是一种跨膜蛋白，广泛分布于细胞膜上，为受体酪氨酸激酶家族成员之一。EGFR与表皮生长因子(EGF)的结合可启动细胞核内相关基因，从而促进细胞分裂增殖。EGFR存在于大多数细胞中，对肿瘤细胞的生长、繁殖、转移、新血管生成、浸润等起到重要作用，在非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌等多种肿瘤中均有表达。

近年来，以EGFR为靶点的分子靶向治疗对晚期NSCLC患者的效果较好。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是EGFR突变型晚期NSCLC的重要治疗手段之一，在客观缓解率和无进展生存期方面均显著优于传统含铂双药联合方案，但大部分患者在治疗6-12个月后即出现EGFR-TKIs耐药，其耐药机制主要包括原发性耐药和获得性耐药。在NSCLC患者中，EGFR突变通常发生在18-21号外显子，其中第19外显子19del位点缺失以及第21外显子L858R位点突变是最常见的EGFR敏感突变，约占总突变的90％，又叫经典突变或热点突变。

目前，组织活检是肿瘤检测的金标准，但由于组织样本的获取存在有创性和局限性，大多数晚期NSCLC患者或复诊患者很难利用重复组织活检来监测机体耐药情况及实时病情，这就使得液体活检技术应运而生。液体活检主要以血液游离核酸(cfDNA)为检测对象，具有更全面地反映肿瘤特性、克服肿瘤异质性难题及非侵入性可多次取样等优点。大量研究表明，cfDNA可作为组织不可取时的首选替代标本，用于评估EGFR基因突变状态，选择是否采用EGFR-TKI治疗方法。cfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简单、无创、具有可重复性，适合用于对NSCLC患者病情进展连续监测，肿瘤预后评估，残余病灶检测等。由于cfDNA在晚期肺癌患者血液中的浓度极低，因此，其对检测灵敏度要求较高，常用的基因突变检测方法如：Sanger测序法、高分辨熔点曲线分析法、实时荧光定量PCR法、变性高效液相色谱技术等均难以满足其检测要求。

因此，本领域迫切需要开发能够有效检测肺癌患者血液中cfDNA的技术以满足临床需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测非小细胞肺癌EGFR基因19外显子突变的试剂盒及方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的检测引物对，所述检测引物对包括检测上游引物和检测下游引物；其中，所述检测上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，所述检测下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本发明的第二方面，提供了一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。

在另一优选例中，所述探针的5’端包含有荧光报告基团FAM；和/或，所述探针的3’端包含有荧光淬灭基团MGB。

本发明的第三方面，提供了一种用于数字PCR检测EGFR基因19外显子突变的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对。