[发明专利]一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)称取10ng～20ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl～4μl的10×Taq DNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体10S～15S后，加入0.4μl～0.8μl的DNA聚合酶，置于15℃～30℃孵育2min～3min，然后加入0.2μl～0.4μl的尿嘧啶N糖基化酶，在0℃～4℃的环境下，震动混合15min～30min；

量取0.1μl～0.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2μl～0.4μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体10S～15S后，将混合液体在60℃～70℃金属浴3min～5min；

量取2μl～4μl的甘油、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.1μl～0.2μl的681G探针、0.1μl～0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液10S～15S，并置于离心机中6000rpm短暂离心10S～30S；

将经过离心的混合液在60℃～70℃金属浴3min～5min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液；

(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号；

(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；

若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；

若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；

并通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定被检测CYP2C19的基因多态性情况，从而确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。

2.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述DNA聚合酶采用活性为2U的HS-Taq。

3.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为25mmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述Mg2+水溶液得浓度为25mmol/L，水溶液采用的溶剂为双蒸水。

5.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述甘油的质量分数为50％。

6.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述上游引物采用681F1，浓度为100μmol/L，下游引物采用681R1，浓度为100μmol/L。

7.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述681G探针和681A探针的浓度都是100μmol/L。

8.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应采用的设备是ABIPRISM7500荧光定量PCR仪。

9.根据权利要求1所述的一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述荧光定量PCR反应的循环参数：

温度95℃、6min、1个循环；

温度95℃、50S、30个循环；

温度60℃，50S，50个循环。