[发明专利]一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法

说明书

本发明涉及一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：称取10ng～20ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl～4μl的10×Taq DNA聚合酶，加入0.4μl～0.8μl的DNA聚合酶，然后加入的尿嘧啶N糖基化酶，脱氧核糖核苷三磷酸和Mg2+水溶液，量取2μl～4μl的甘油、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.1μl～0.2μl的681G探针、0.1μl～0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，加入适量的双蒸水。结果判定:通过△Ct、CtV和CtF具体值，确定携带被检测基因的人群对药物的反应是慢代谢型、快代谢型或者中间代谢型。有益效果：不需要针对每种基因型设置一个PCR反应，操作简便；适用于两通道荧光定量PCR仪，具有特异、灵敏、快速、操作方便等优点。

技术领域

本发明涉及生物技术领域领域，具体涉及一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法。

背景技术

细胞色素氧化酶CYP2C19参与了华法林、氯吡格雷、地西泮、普奈洛尔、奥美拉挫等药物代谢，其基因多态性是导致药效存在个体差异的重要影响因素。CYP2C19基因多态性的临床检测方法包括：限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)、等位基因特异PCR、DNA测序和基因芯片技术等，但这些方法操作繁琐，难以满足临床常规检测需求。荧光定量PCR法检测具有高敏感性、高特异性、操作简便、结果判断简单等特点，便于临床常规检测应用。所以可以通过建立一种简单、准确的荧光定量PCR法，旨在检测CYP2C19基因681位点和636位点的核苷酸类型，为相关药物的临床使用提供参考。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于CYP2C19基因的荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

(1)称取10ng～20ng的CYP2C19基因组DNA，加入2μl～4μl的10×Taq DNA聚合酶(不含Mg2+)，手动剧烈振荡管体10S～15S后，加入0.4μl～0.8μl的DNA聚合酶，置于15℃～30℃孵育2min～3min，然后加入0.2μl～0.4μl的尿嘧啶N糖基化酶，在0℃～4℃的环境下，震动混合15min～30min；

量取0.1μl～0.2μl的脱氧核糖核苷三磷酸和0.2μl～0.4μl的Mg2+水溶液，混合均匀后，加入至上述混合液体内，手动剧烈振荡管体10S～15S后，将混合液体在60℃～70℃金属浴3min～5min；

量取2μl～4μl的甘油、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.05μl～0.1μl的下游引物、0.1μl～0.2μl的681G探针、0.1μl～0.2μl的681A探针，加入至上述混合液体内，轻摇溶液10S～15S，并置于离心机中6000rpm短暂离心10S～30S；

将经过离心的混合液在60℃～70℃金属浴3min～5min，取出后立即冰水浴至室温，然后加入适量的双蒸水，直至混合液体达到40μl，即获得CYP2C19的PCR反应溶液。

(2)将步骤(1)中获得CYP2C19的PCR反应溶液置于反应管放入荧光定量PCR仪器中，收集60℃时的荧光信号；

(3)结果判定:记录每个检测FAM通道的Ct值(记为CtF)和VIC通道的Ct值(记为CtV)，计算Ct差值的绝对值△Ct＝|CtF－CtV|；

若△Ct＜3.0，该位点判断为杂合突变型；

若△Ct＞3.0，分两种情况判断：当CtF＜CtV时，该位点判断为纯合野生型；当CtV＜CtF时，该位点判断为纯合突变型；