[发明专利]一种CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法

权利要求书

1.一种CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.选取待测茶树品系，取茶树品系茶叶的顶芽、第二叶、第三叶、老叶；

S2.分别提取茶叶的顶芽、第二叶、第三叶、老叶的RNA序列；

S3.将提取的RNA序列分别反转录成cDNA；

S4. 以cDNA为模板，通过特异性引物对进行PCR扩增； S5.对PCR扩增的产物进行测序，检测分析CsTTG1在茶叶茸毛生长发育线性关系中是否具有特异性表达：将PCR扩增产物用融解曲线分析，采用Roche公司的LightCylcer480软件收集数据，在茶树不同的样品间相对表达量的计算，用CT值的2^-△CT法处理获得其茶叶茸毛生长发育线性关系；

步骤S4中，所述PCR扩增的方法包括将反转录产物为模板、通过PCR扩增引物进行qRT-PCR反应，所述PCR扩增引物其上游引物和下游引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示。

2.根据权利要求1所述的CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法，其特征在于，步骤S2中，所述茶叶的RNA序列提取方法包含以下步骤：

（1）往预冷的2.0ml的离心管中加入700uml的Buffer PRC1液；

（2）称取50-100mg样品材料置于加有液氮的研钵中，迅速磨成粉末状并转到第1步的离心管中，高速涡旋60秒打散样品，冰上放置5min ，55℃短暂水浴1分钟；

（3）冷却到室温，14000rpm离心5min；

（4）把gDNA过滤柱装在2ml收集管中，把第3步的上清液转移在gDNA过滤柱中，14000rpm离心2min，弃掉gDNA过滤柱；

（5）加入0.5倍体积的无水乙醇至滤纸中，移液枪吸打3-5次，按第6步进行操作；

（6）把HiPure RNA Mini Column 装在2ml收集中，转移700ul 混合液至柱子中，10000rpm离心60s；

（7）倒弃滤液，把柱子装回收集中，加入500ul Buffer RW1至柱子上，10000rpm离心60s；

（8）倒弃滤液，把柱子装回收集中，加入600ul Buffer RW2至柱子上，10000rpm离心60s；

（9）重复步骤8；

（10）弃掉滤液，把柱子重新装回收集管中，10000rpm离心2min；

（11）将柱子转移至1.5ml离心管中；

加入50ulRNase Free Water至柱子膜中央，室温静置2min，10000rpm离心1min；

（12）弃掉柱子，采用2%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，以此判断RNA产量和质量。

3.根据权利要求2所述的CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法，其特征在于，所述HiPure RNA Mini Column的柱容量为1.5mL，洗脱体积为50-100uL。

4.根据权利要求2所述的CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法，其特征在于，所述HiPure RNA Mini Column的柱容量为15mL，洗脱体积为0.3-0.6mL。

5.根据权利要求1所述的CsTTG1基因与茶叶茸毛生长发育线性关系的鉴定方法，其特征在于，步骤S3中，所述RNA序列分别反转录成cDNA的方法，包含以下步骤：

（1）基因组DNA去除，在RNase free 的离心管中配置如下混合液4 x gDNA wipe Mix1-4ul；模板RNA 1-4ul；RNase free ddH₂O 2-7ul；用移液枪轻轻吹打混匀，放于水浴锅中水浴38-50℃ 1-4min；

（2）配置逆反转录反应体系，在以上体系中加入5x HiScript ║ qRT SuperMix║ 1-4ul，用移液枪轻轻吹打混匀；

（3）进行逆转录反应，15-30℃ 7-15min，40-60℃ 22-42min，72-90℃ 3-8min。