[发明专利]蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用

说明书

本发明公开了一种蓝色犁头霉中甾类11β‑羟化酶及其编码基因与应用。本发明所提供的甾类11β‑羟化酶为至少含有SEQ ID No.1的第19‑527位，并且从SEQ ID No.1的第19位开始向SEQ ID No.1的N端延长，得到长度为509‑526位氨基酸的任意一个蛋白质(Ac‑CYP003蛋白)。另外本发明还提供了由甾类11β‑羟化酶和氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质(Ac‑CPR蛋白)组成的成套蛋白。本发明在异源微生物中表达Ac‑CYP003蛋白(或其与Ac‑CPR蛋白)，进行氢化可的松(HC)的催化合成，避免其他副产物的生成，提高了RSA到HC的转化率。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及蓝色犁头霉中甾类11β-羟化酶及其编码基因与应用。

背景技术

氢化可的松(Hydrocortisone，HC)化学名为11β,17α,21-三羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮，是肾上腺糖皮质激素药物，在激素类药物中占与重要地位，其结构式如图1中所示。HC能够影响糖代谢，具有抗病毒、消炎、抗过敏及抗休克等作用[Dumas,B.,et al.,Hydrocortisone made in yeast:metabolic engineering turns a unicellularmicroorganism into a drug-synthesizing factory.Biotechnol J,2006.1(3):299-307.]。主要用于肾上腺皮质功能不全引起的疾病及先天性肾上腺皮质功能增生等症状的治疗，也可用于支气管哮喘、类风湿性关节炎、痛风、风湿性发热等炎症性及过敏性疾病的治疗，还可以用于严重性感染和抗休克治疗等。

HC的合成方法主要分为三类：全化学合成法、半合成法及全生物合成的方法[Colingsworth,D.R.,et al.A partial microbiological synthesis ofhydrocortisone.Journal of Biological Chemistry 203.2(1953):807.]。1950年，Wendler等用化学全合成的方法经30多步化学反应成功合成HC，但因其工艺复杂，总收率太低，而无工业生产价值。Dumas等[Szczebara,F.M.,et al.,Total biosynthesis ofhydrocortisone from a simple carbon source in yeast.Nat Biotechnol,2003.21(2):143-149.]在酿酒酵母中使用人来源的11位β羟基化P450(CYP11B1)实现以葡萄糖为唯一碳源生物法全合成氢化可的松，但由于合成途径复杂，产物得率较低也并没有实现工业化生产。目前国内外制备HC等甾体药物依然主要采用半合成的方法，即以薯蓣皂素或植物甾醇等前体通过化学合成获得药物中间体17α-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯(Cortexolone-21-acetate,RSA)或11-脱氧皮质醇(11-deoxycortisol，RS)，然后通过犁头霉菌(Absidia orchidis)和新月弯孢霉(Curvularia lunata)等微生物的生物全细胞催化反应对其11位进行β羟基化反应获得HC[Kim,Y.H.,et al.,Synthesis of α-ketoglutarate using glutamate dehydrogenase combined with electrochemicalcofactor regeneration system.Journal of Bioscience and Bioengineering,2009.108:S45-S46.Manosroi,J.,Y.Chisti,and A.Manosroi,Biotransformation ofcortexolone to hydrocortisone by molds using a rapid color-developmentassay.Applied Biochemistry and Microbiology,2006.42(5):479-483.]。氢化可的松合成工艺见图2。