[发明专利]一种维生素D代谢物的检测方法

说明书

本发明提供一种维生素D代谢物的检测方法，所述方法包括步骤：以有机溶剂萃取血清样品中分析物，即维生素D代谢物；在吹干的萃取剩余物中加入衍生试剂4‑苯基脲唑和二乙酰氧基碘苯以发生狄尔斯阿尔德反应。本发明用液相色谱‑串联质谱法检测维生素D代谢物。该方法成本低，反应时间快，灵敏度高，抗干扰力强。

技术领域

本发明涉及分析检测领域，具体的涉及一种代谢物的检测方法。

背景技术

维生素D(包括D2和D3)是一类人体必须的脂溶性维生素，源于紫外线照射下的人体内合成和食物补充。经过肝脏和肾脏代谢，会产生一系列代谢物，其名称和化学结构如图1 和2所示。其中，25-羟基维生素D3、D2已有大量临床研究，与诸如儿童佝偻病，冠心病，糖尿病，小儿头疼，癌症等众多疾病有密切关系已被证实。1α,25二羟基维生素D3是其中的一种活性代谢物。近来研究表明，1α,25-二羟基维生素D3可促进小肠对钙磷的吸收，维持钙、磷正常代谢及骨骼矿化，调节钙、磷在肾脏的重吸收。被用作为肾相关疾病的生物标志物，而且直接作用于骨代谢的骨骼细胞上。1α,25-二羟基维生素D3还影响二型糖尿病人血清中维生素D受体的表达。

基于上述论及的广泛临床研究，维生素D代谢物已成为当今公认的疾病和健康的生物标志物，对其检测将对疾病诊断和健康评价具有重要意义。然而，由于其体内含量极低，且多种不同代谢物结构极相似，使得建立有效、实用的检测方法仍极具挑战性。目前常规的检测方法已难以满足检测的需要。问题主要表现为：1)常规的免疫法(包括酶联免疫和放射免疫法)难以做到多种代谢物的同时检测，且对不同代谢物的检测需要不同的抗体，从而使得该方法成本高。而且，有的代谢物市场上还无抗体出售，这类方法就无法应用；2)直接HPLC-UV 或HPLC-MS法尽管可同时检测不同异构体代谢物，但灵敏度尚满足不了对低含量异构体(如 1α,25-二羟基维生素D)的检测的需要，原因是其分子结构决定了其低的UV吸收，和低的质谱响应。

当今流行的高灵敏检测方法为借助化学衍生化的LC-MS/MS方法。化学衍生化是提高质谱检测灵敏度的常用方法，目前已有多种衍生化系统报道，如DAPTAD衍生化法，ABSCIEX 公司试剂盒Amplifex Reagent衍生化法等。但最常见的、普遍使用的衍生试剂为 4-phenyl-1,2,4-triazoline-3,5-dione(PTAD，4-苯基-1,2,4-三唑啉-3,5-二酮)[Frederick G. Strathmann,Thomas J.Laha,and Andrew N.Hoofnagle,ClinicalChemistry,2011,57(9), 1279–1285]。该类试剂价格比较高，而且衍生时间也较长。此外，有些异构体代谢物，如 1α,25(OH)₂D3和4β,25(OH)₂D3，LC-MS/MS尚难以对二者加以区分。已有的解决方法是免疫分离法或预氧化去除4β,25(OH)₂D3，但涉及复杂繁琐的样品处理[Zhican Wang,Tauri Senn, Tom Kalhorn et al,Analytical Biochemistry,2011,418,126–133]。如专利公开号 CN105651901A，北京洛奇临床检验所股份有限公司于2016年4月11日申请的中国专利“干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法及试剂盒”°，就是采用PTAD作为衍生剂。该发明涉及一种干血片样品中25羟基维生素D的液相色谱串联质谱检测方法，其前处理工艺，主要包括样本前处理、衍生、复溶工序，同时采用多反应监测MRM扫描方式，该方法实现干血片中25羟基维生素D的高通量液相色谱串联质谱检测，解决传统液相色谱串联质谱方法样本量需求量量大、采样、运输不方便的问题，但是还是未解决成本高的问题。

另外，LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)检测维生素D另一问题是空白基质。做定量时配制标准曲线和质控样品的理想基质是不含分析物的人血清，但这类基质难以得到，需要寻找代替品。

因此，本领域迫切需要开发一种成本低、速度快、准确度高的维生素D代谢物的检测方法。

发明内容