[发明专利]一种即用型3D细胞生长支架及其制备方法

说明书

本发明涉及一种即用型3D细胞生长支架及其制备方法，属于细胞培养技术领域，该方法包括如下步骤：将细胞外基质溶液均匀覆盖在基底上，于‑80℃下静置4‑12h，然后真空冷冻干燥24‑36h后置于交联剂中浸泡12‑24h，洗涤、烘干，制得即用型3D细胞生长支架。该即用型3D细胞生长支架不但可以为细胞培养提供三维生长环境，而且可以长期保存，有效的避免了现有技术中需要现配现用的缺点，简化了实验操作流程。该支架制备方法简单，原料来源广泛，且成本低，适合大规模工业化生产。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种即用型3D细胞生长支架及其制备方法。

背景技术

细胞是生物体基本的结构和功能单位，细胞的特殊性决定了个体的特异性，细胞的多样性决定了生物的多样性。因此，对细胞的深入研究是揭开生命奥秘、改造生命和征服疾病的关键。但是我们现在对生物体的理解很大部分依赖于同一种细胞群在平面、二维(2D)塑料或者玻璃基底上的培养研究。然而，在生物体内细胞主要存在于一个复杂且物质丰富的环境中，包括多种细胞外基质(ECM)、异型相互作用的细胞群及各种细胞因子的混合物。

传统的二维(2D)细胞培养是将细胞从组织中分离，置于平面基底上进行培养，具有简单、易操作、费用低等优点。通过二维细胞培养人们对细胞的基本生物学机制(迁移、分化)有了大部分的了解，但是，人们逐渐发现二维培养细胞得到的实验结果往往不能在动物体内得到重复，存在这类差异的主要原因在于二维培养的细胞虽然能在体外繁殖和分化，但其生长发育的环境和条件与体内细胞生长环境差异较大，进而导致细胞的基因表达和形态特征与体内差异较大。例如：将细胞从组织中分离置于平面基底进行培养时，许多的细胞类型逐渐变得扁平、异常分裂并失去其分化类型。有趣的是，当将这类细胞嵌入三维细胞培养环境中时，一些细胞可以恢复其生理形态和功能，将分化的去软骨细胞嵌入3D培养环境中，恢复了它们的生理表型，包括细胞形态和软骨标志物的表达。

三维(3D)细胞培养是指将动物细胞与具有三维结构的支架材料共同培养，使细胞能够在三维立体空间生长、增殖和迁移，构成三维的细胞-细胞或细胞-载体复合物，从而更好的模拟细胞在体内的生长环境。3D细胞培养主要分为有支架的细胞培养和无支架的细胞培养，支架的主要作用是为细胞提供一个附着和生长的多孔结构，依附于支架进行生长和迁移。主要的支架材料有胶原和水凝胶等，价格较低且操作简单。无支架的三维细胞培养主要通过物理方法使贴壁细胞悬浮于培养基中，达到三维培养的目的，目前主要的技术有微载体、磁悬浮、悬滴板和磁性三维生物印刷等技术，但这类方法操作复杂、前期投入较大，因此绝大多数的三维细胞培养借助于支架材料。已经有大量的生物支架材料被我们开发来研究3D细胞之间的相互作用，这类材料通常以含有悬浮细胞的液体为前提，通过一定的方式凝胶化或固化，随后生成的凝胶具有多孔结构，能够进行营养物质和废物的交换，通过调节自身厚度，来提供一定的机械强度，最基本的生物学功能是向凝胶中添加细胞粘附配体来实现，通常以Arg-Gly-Asp肽的形式。天然的ECM已经成为生物学家的重要工具，这类材料来源于动物和人体，其网状结构、成分、生物力学环境适合细胞的增殖、粘附及新陈代谢，这类材料主要包括胶原、Matrigel、壳聚糖、明胶等。人工合成的高分子材料大部分情况下是使用静电纺丝的方法合成，这类材料的制备更加标准化，但是前期投入较大，材料亲水性差，不利于细胞的粘附。随着Whitesides课题组首次提出“cell-ingel-in-paper”这一概念，人们将天然ECM与纸基相结合，利用纸的纤维结构，模拟支架材料，将纸基浸入含有细胞悬液的的ECM中，让纸基纤维中填充满细胞悬液，将多层纸基堆叠，形成一个可以自由组装和拆卸的3D细胞培养平台。

但是，无论是天然ECM还是高分子合成材料，以及后来的纸基，均存在着在使用过程中需要将细胞悬液与基质相混合的过程，并且要现配现用，从而使整个实验过程变得繁琐，操作极为不便。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种即用型3D细胞生长支架的制备方法；目的之二在于提供一种即用型3D细胞生长支架。