[发明专利]检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板，以及在底板上依次地搭接粘贴的滤纸，样本垫，玻璃纤维垫，硝酸纤维素膜和吸水纸，其中所述的玻璃纤维垫上喷涂有荧光微球和胶体金分别标记了沙丁胺醇单抗的复合物，所述的硝酸纤维素膜上包被有沙丁胺醇人工抗原作为检测线和包被有山羊抗小鼠抗体作为质控线；

时间分辨荧光微球是直径为0.01～10μm的较长荧光半衰期的稀土离子作为标记物来制备的包裹荧光物质的特殊微球，所述荧光微球表面连接有活性基团；所述荧光物质包括有机或无机的荧光物质或多种荧光物质的掺杂物以及量子点；

所述的胶体金颗粒是直径为10～100nm的采用柠檬酸三钠还原氯金酸来制备的金颗粒，所述的胶体金颗粒表面带有负电荷，可以与蛋白质进行偶联；

制备方法包括如下的步骤：

⑴硝酸纤维素膜上包被有沙丁胺醇人工抗原作为检测线和包被有山羊抗小鼠抗体作为质控线的制备方法：

①制备沙丁胺醇人工抗原

将沙丁胺醇标准品与蛋白大分子通过共价偶联法制备质控区所需的人工抗原，偶联方法为：碳二亚胺法，偶联蛋白为牛血清白蛋白，偶联比为1:50-1:100，偶联后透析纯化，得到沙丁胺醇人工抗原；

②检测线和质控线的制备

沙丁胺醇人工抗原和山羊抗小鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上；用0.01M pH6.0的磷酸盐缓冲溶液稀释沙丁胺醇人工抗原使沙丁胺醇人工抗原浓度为1mg/mL，所得的溶液在硝酸纤维素膜上喷涂作为检测线；用0.05M pH 7.2的磷酸盐缓冲溶液稀释山羊抗小鼠抗体使山羊抗小鼠抗体浓度为1mg/mL，所得的溶液在硝酸纤维素膜上喷涂作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用；

⑵玻璃纤维垫上喷涂有荧光微球和胶体金分别标记了沙丁胺醇单抗的复合物的制备方法

①荧光微球标记沙丁胺醇单抗的制备：取1mg荧光微球超声1分钟，用0.01M pH6.0的硼酸盐缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，然后加入EDC使EDC终浓度为80mg/mL，振荡混匀后，室温孵育30min后，加入沙丁胺醇单克隆抗体使沙丁胺醇单克隆抗体终浓度为12μg/mL，充分混合后，室温搅拌反应3h，然后加入牛血清白蛋白使牛血清白蛋白终浓度为1％，室温反应1h，6000×g离心力离心15min，沉淀用包含5％蔗糖和0.05％Tween-20的0.01M pH 6.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积后，于4℃保存待用；

②胶体金标记沙丁胺醇单克隆抗体的制备：取40mL粒径30nm的胶体金，用0.02M的碳酸钾溶液调节胶体金的pH为7.5，加入沙丁胺醇单克隆抗体使沙丁胺醇单克隆抗体终浓度为18μg/mL，充分混合后，室温搅拌反应1h，加入牛血清白蛋白使牛血清白蛋白终浓度为1％，室温反应1h，5000×g离心力离心15min，沉淀用包含5％蔗糖和0.05％Tween-20的0.05M pH7.5的磷酸盐缓冲液复溶为1/10起始体积后，于4℃保存待用；

③按照每张试纸条中不同标记物上的抗体量来计算，精确到胶体金标记抗体量为35ng/条、荧光微球标记抗体量为5ng/条的浓度来进行结合垫的喷涂，喷涂至30×0.8cm的玻璃纤维膜上，25℃真空干燥1～2h，放于干燥柜中备用；检测结果为：在步骤③的条件下标准曲线浓度为：0、0.1、0.3、0.9、1.5、2.7ng/mL，R²为0.9908，IC50为0.29ng/mL，线性回归方程式为：y＝-0.1876x+0.1987；

⑶组装试纸条

①滤纸和样本垫规格为1×30cm；

②喷涂有荧光微球-胶体金复合物的玻璃纤维，规格为0.8×30cm；

③已喷好检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；

④吸水纸，规格为1.2×30cm；

⑤PVC底板，规格为5.5×30cm；

将以上材料依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存。

2.如权利要求1所述的一种检测沙丁胺醇的荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光微球-胶体金双显色定性定量免疫层析试纸条检测样本中沙丁胺醇的方法，包括如下的步骤：

①在试纸加样孔中加入110μL样本，反应10min；

②目测试纸条检测线和质控线出现的红色条带情况；

③如果检测线显色比质控线显色深，则样本中沙丁胺醇的含量小于0.5ng/mL，定性判断为阴性，反之，如果检测线显色比质控线显色浅，或者检测线没有显示红色条带，则样本中沙丁胺醇含量大于0.5ng/mL，定性判断为阳性；

④根据胶体金红色条带显示的结果，如果样本为阳性时，将试纸条插入荧光读取仪的检测窗口，检测线和质控线荧光的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中沙丁胺醇的含量，实现阳性样本的定量检测，胶体金显色后，在20分钟内读取的荧光数据均有效。