[发明专利]一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法有效
| 申请号： | 201810905472.X | 申请日： | 2018-08-10 |
| 公开（公告）号： | CN109022380B | 公开（公告）日： | 2021-07-23 |
| 发明（设计）人： | 吴黎诚;郭小雷;章权 | 申请（专利权）人： | 浙江正硕生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/06 | 分类号： | C12N9/06;C12N9/08;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 浙江千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人： | 裴金华 |
| 地址： | 313000 浙江省湖州市吴兴区康*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 提高 氨基酸 脱氨酶 表达 方法 | ||
1.一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，采用L-氨基酸脱氨酶基因与过氧化氢酶基因串联表达；所述L-氨基酸脱氨酶基因来源于奇异变形杆菌，所述L-氨基酸脱氨酶基因的genbank登录号为EU669819.1；过氧化氢酶基因来源于嗜冷杆菌，所述过氧化氢酶基因的genbank登录号为EU543218；在过氧化氢酶基因片段上游加上DNA片段，所述DNA片段序列为SEQ NO.1所示序列。
2.根据权利要求1所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：
1.重组菌构建
构建L-氨基酸脱氨酶基因质粒laad，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAAD；
构建过氧化氢酶基因质粒pkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PKTA；
在质粒pkta上的过氧化氢酶基因片段上游加上DNA片段后，HindⅢ/XhoⅠ双酶切所得目的片段，同时采用HindⅢ/XhoⅠ双酶切质粒laad，连接，构建串联表达质粒pmlaadpkta，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAADPKTA；所述DNA片段序列为SEQ NO.1所示序列；
2.重组菌表达
采用TB培养基进行发酵。
3.根据权利要求2所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，
(1)菌种活化；
(2) 一级种子：从平板上挑取单菌至装有LB培养基的试管，加Kan至终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养过夜；
(3) 二级种子：取一级种子新鲜菌液按2%接种量接种于含LB培养基的摇瓶，加Kan至终浓度为100mg/L，37℃，220rpm培养3.0-3.5h，OD600为1.0；
(4) TB发酵：二级种子2%-10%的接种量接入TB培养基，加Kan至25mg/L，37℃，220rpm，培养3h，开始降温25℃；加IPTG至终浓度为0.1mM，220rpm，25度，培养过夜；
(5) 发酵20-24h，收集菌体。
4.根据权利要求2所述一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，其特征在于，构建L-氨基酸脱氨酶基因质粒laad和过氧化氢酶基因质粒pkta采用pET28a载体。
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