[发明专利]一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法

说明书

本发明属于基因工程领域，涉及一种提高L‑氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，采用L‑氨基酸脱氨酶（L‑amino acid deaminase，LAAD）基因与过氧化氢酶（Catalase）基因串联表达。本发明采用L‑氨基酸脱氨酶串联过氧化氢酶进行表达，提高了单位菌体的酶活，也提高了单位发酵体积菌体的量，从而具有很高的工业化运用价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法。

背景技术

L-氨基酸脱氨酶（LAAD, L-Amino Acid Deaminase），也可以称作L-氨基酸氧化酶(LAAO，L-Amino Acid Oxidase, EC 1.4.3.2)，是一类黄素蛋白（flavoenzyme）对天然和非天然的L-氨基酸具有广谱的α位脱氨活性。LAAD在氧的参与下氧化L-氨基酸脱α-氨基，生成酮酸和氨，并产生副产物双氧水。L-氨基酸脱氨酶可用于氧化L-氨基酸的氨基制备对应的α-酮酸或用于氧化消旋氨基酸中的L-氨基酸来制备D-氨基酸。无论是α-酮酸或D-氨基酸都是重要的医药中间体。

过氧化氢酶（Catalase），主要来源于微生物及动物肝脏（如牛肝），并被工业化开发运用于分解双氧水（H₂O₂），消除双氧水对其所在环境中其它物质的氧化破坏。

L-氨基酸脱氨酶来源多种微生物，如Proteus、ProÍidencia、Morganella属，另外蛇毒中L-氨基酸脱氨酶也被商业化运用，只是太昂贵而不能广泛使用。微生物来源的L-氨基酸脱氨酶较容易进行基因操作，并可通过发酵获得酶。采用大肠杆菌表达有活性的L-氨基酸脱氨酶时，L-氨基酸脱氨酶在细胞内会对细胞内的氨基酸进行脱氨反应并产生双氧水，而双氧水对细胞产生毒害，造成细胞过早自溶，从而使得单位菌体的酶活表达量小，同时单位发酵体积的菌体量少，严重影响了工业化运用。

发明内容

本发明提供一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，L-氨基酸脱氨酶串联表达过氧化氢酶，提高了单位菌体的酶活，也提高了单位发酵体积菌体的量，从而具有很高的工业化运用价值。

本发明采用如下的技术方案：一种提高L-氨基酸脱氨酶异源表达酶活的方法，采用L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）基因与过氧化氢酶（Catalase）基因串联表达。

作为优选，采用奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1）LAAD与嗜冷杆菌（Psychrobacterpiscatorii T-3）的过氧化氢酶（Catalase）基因（genbank登录号EU543218）PKTA串联表达。

作为优选，在PKTA基因片段上游加上DNA片段，所述DNA片段序列为：aagctttctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc。

具体操作步骤如下：

1.重组菌构建

全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1）LAAD，并连入pET28a载体（NdeⅠ/Hind），构建质粒laad，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAAD；