[发明专利]一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法在审
| 申请号： | 201810905503.1 | 申请日： | 2018-08-10 |
| 公开（公告）号： | CN109022412A | 公开（公告）日： | 2018-12-18 |
| 发明（设计）人： | 吴黎诚;郭小雷;章权 | 申请（专利权）人： | 浙江正硕生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N11/12 | 分类号： | C12N11/12;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19 |
| 代理公司： | 杭州千克知识产权代理有限公司 33246 | 代理人： | 裴金华 |
| 地址： | 313000 浙江省湖州市吴兴区康*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 脱氨酶 氨基酸 纤维素结合域 微晶纤维素 基因片段 固定化 生物技术领域 多次使用 固定过程 副产物 酶纯化 酶催化 融合 | ||
1.一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，将纤维素结合域融合至L-氨基酸脱氨酶的C端或N端。
2.根据权利要求1所述一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，纤维素结合域来源于热纤维梭菌的纤维素结合域，genbank登录号AF283517.1。
3.根据权利要求1或2所述一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，L-氨基酸脱氨酶来源于奇异变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶，genbank登录号EU669819.1。
4.根据权利要求3所述一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）基因片段通过一段DNA短链连接至L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）基因片段的3’或5’端。
5.根据权利要求4所述一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，DNA短链的序列为：GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGA。
6.根据权利要求4所述一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，包括步骤：1.重组菌构建：全基因合成两个基因片段LAAD和CBD，CBD基因片段通过一段DNA短链连接至LAAD基因片段得3’或5’端，并连入pET24a载体，构建质粒LAAD-CBD，转化至E.Coli BL21（DE3），构建重组菌PMLAAD-CBD；2. 重组菌表达；3.固定化。
7.根据权利要求6所述一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，其特征在于，步骤3固定化的具体操作为：
1）菌体加5-6倍体积的水，分散均匀，再破胞两次；
2）高速离心，获得上清酶液；
3）酶液加入与菌体量等量的微晶纤维素，20-30℃震荡混合2h；
4）过滤，收集固定化粗酶，用20-100mM、pH7-8.5的磷酸钾缓冲液洗涤、过滤，得固定化L-氨基酸脱氨酶。
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