[发明专利]一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及一种固定L‑氨基酸脱氨酶的方法，将纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）基因片段通过一段DNA短链连接至L‑氨基酸脱氨酶（L‑amino acid deaminase，LAAD）基因片段的3’或5’端。本发明将L‑氨基酸脱氨酶融合纤维素结合域，与微晶纤维素结合而固定，由于微晶纤维素廉价易得，固定化成本低，而且固定过程的特异性起到了对酶纯化的作用，使得酶催化的副产物极少。固定化L‑AAD‑CBD由于成本低，可多次使用，具有较大的工业化运用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法。

背景技术

L-氨基酸脱氨酶（LAAD, L-Amino Acid Deaminase），也可以称作L-氨基酸氧化酶(LAAO，L-Amino Acid Oxidase,EC 1.4.3.2)，是一类黄素蛋白（flavoenzyme）对天然和非天然的L-氨基酸具有广谱的α位脱氨活性。LAAD在氧的参与下氧化L-氨基酸脱α-氨基，生成酮酸和氨，并产生副产物双氧水。L-氨基酸脱氨酶可用于氧化L-氨基酸的氨基制备对应的α-酮酸或用于氧化消旋氨基酸中的L-氨基酸来制备D-氨基酸。无论是α-酮酸或D-氨基酸都是重要的医药中间体。

L-氨基酸脱氨酶来源多种微生物，如Proteus、ProÍidencia、Morganella属，另外蛇毒中L-氨基酸脱氨酶也被商业化运用，只是太昂贵而不能广泛使用。

微生物来源的L-氨基酸脱氨酶较容易进行基因操作，并可通过发酵获得酶。但L-氨基酸脱氨酶的酶活较低，工业化运用的成本比较高，需要采用固定化酶工艺，反复多次使用酶，从而降低酶的使用成本。

发明内容

本发明克服现有的微生物来源的L-氨基酸脱氨酶酶活较低，工业化运用的成本比较高的缺陷，提供一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法。

本发明采用如下的技术方案：

一种固定L-氨基酸脱氨酶的方法，将纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）融合至L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）的C端或N端。

作为优选，纤维素结合域来源于热纤维梭菌（Clostridium thermocellum）的纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）（genbank登录号AF283517.1）。

作为优选，L-氨基酸脱氨酶来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)的L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）（genbank登录号EU669819.1）。

作为优选，纤维素结合域（cellulose binding domain，CBD）基因片段通过一段DNA短链连接至L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）基因片段的3’或5’端。

DNA短链的序列为：GGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGGA。

具体的操作步骤包括：

1. 重组菌构建