[发明专利]鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法

权利要求书

1.一种冷水鱼病原菌检测方法，包含：

提供一可能含有在冷水鱼中的病原菌的一或多个核苷酸序列的样本；

提供一寡核苷酸引子对，所述寡核苷酸引子对定义在所述病原菌的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；

提供一聚合酶；

在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引子对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；

透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行隔绝恒温聚合酶连锁反应(insulated isothermal polymerase chain reaction,iiPCR)，以形成一PCR产物；

侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscinereovirus,PRV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:5,31,34以及36所组成的群组。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为感染性胰脏坏死病毒(infectiouspancreatic necrosis virus,IPNV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:7所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:8或9所示。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus,SAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:11,12以及13所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:14,15以及16所组成的群组。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述病原菌为感染性鲑鱼贫血病毒(infectioussalmon anemia virus,ISAV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NOs:18或19所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:20或21所示。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述病原菌为鱼呼吸道与肠道病毒(piscinereovirus,PRV)，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列选自于由SEQ ID NOs:4,30,32,33以及35所组成的群组，所述第二引子的序列选自于由SEQ ID NOs:5,31,34以及36所组成的群组，且所述寡核苷酸探针为一介于所述病原菌PRV的L1区段基因的第3178至第3287个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NOs:6或37所示。