[发明专利]鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法

说明书

一种鱼呼吸道与肠道病毒、感染性胰脏坏死病毒、鲑鱼甲病毒、感染性鲑鱼贫血病毒检测方法。本发明涉及一种检测冷水鱼中病原菌的方法。此外，本发明并涉及用于检测冷水鱼中病原菌的寡核苷酸对。

此案是中国专利201510183810.X案的分案申请。

技术领域

本发明涉及在冷水鱼中检测病原菌的方法，特别是涉及使用寡核苷酸对检测冷水鱼病原菌的方法。

背景技术

冷水鱼的经济价值已达到数十亿美金，其中大西洋鲑鱼为最大的单一养殖种类，且其数量于2013年已超过150万吨。冷水鱼疾病可造成高达超过90％的死亡率，但一般较常见的死亡率为10-30％，这样的死亡率对于水产养殖业仍是巨大的负面经济因素，造成一年数亿美金的损失。这些疾病可能在生产周期的早期与晚期发生，其中发生在晚期对经济的冲击最大。

解决上述问题的关键在于，诊断冷水鱼之病原菌且采取必要措施以避免高死亡率。由于冷水鱼养殖业通常分散在偏远的沿海地区，因此本发明即提供了快速、分散的冷水鱼病原菌检测方法以供产业利用。

发明内容

于一方面，本发明涉及一种冷水鱼病原菌检测方法，包含提供一可能含有在冷水鱼中的病原菌的一或多个核苷酸序列的样本；提供一寡核苷酸引子对，所述寡核苷酸引子对定义在所述病原菌的一或多个核苷酸序列上一双股目标序列的二互补股的5’端；提供一聚合酶；在一容器中混合所述样本、所述寡核苷酸引子对、所述聚合酶、脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphates,dATPs)、脱氧胞核苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphates,dCTPs)、脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosine triphosphates,dGTPs)，以及脱氧胸苷三磷酸(deoxythymidine triphosphates,dTTPs)，以形成一聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,PCR)混合物；透过在一固定温度下加热所述容器的底部，使所述PCR混合物进行隔绝恒温聚合酶连锁反应(insulated isothermal polymerase chainreaction,iiPCR)，以形成一PCR产物；以及侦测所述PCR产物以辨识所述双股目标序列。

在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包含一与所述双股目标序列的一区段互补的序列、一附加于所述寡核苷酸探针上的一第一位置的荧光分子，以及一附加于所述寡核苷酸探针上的一第二位置的荧光抑制分子，当所述寡核苷酸探针未杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光抑制分子大体上抑制所述荧光分子，且当所述寡核苷酸探针杂合于所述双股目标序列的所述区段时，所述荧光分子大体上未被抑制。

在某些具体实施例中，所述病原菌为Candidatus Branchiomonas cysticola，且所述寡核苷酸引子对包含一第一引子与一第二引子，所述第一引子的序列如SEQ ID NO:1所示，所述第二引子的序列如SEQ ID NO:2所示。在某些具体实施例中，所述聚合酶连锁反应(PCR)混合物进一步包含一寡核苷酸探针，其为一介于所述病原菌CandidatusBranchiomonas cysticola的16S核糖体RNA基因(GenBank accession No.JQ723599)的第136至第225个核苷酸之间的13至25个碱基对的寡核苷酸。在某些较佳具体实施例中，所述寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO:3所示。