[发明专利]一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法与应用

权利要求书

1.一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于：(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加氨苄青霉素(100mg/L)30-37℃，220rpm，培养12-16h，得到一级种子；

(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中，30-37℃，200-250rpm，培养2-5h，加IPTG至终浓度0.6mM，28-32℃，180-220rpm，培养10-12h；所述发酵培养基组分如下：胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L；

(3)离心收菌，得到菌体，压榨破胞，加壳聚糖溶液絮凝，高速离心，获得上清酶液，加入固定化载体EP200，25℃搅拌混合12-24h，三足式离心收集固定化酶，用50mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)，多次洗涤，过滤，获得固定化酶；

(4)固定化酶20g，加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14-16g/L的丙酮酸钠、10-12g/L的邻苯二酚、40-45g/L的氯化铵、2-5g/L的亚硫酸钠、1-3g/L的EDTA，调pH7.5-8.5。

2.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于，所述的LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物0.5g/L、氯化钠10g/L、纯水。

3.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于，所述的发酵培养基包括胰蛋白胨12g/L、酵母提取物24g/L、甘油5g/L，磷酸二氢钾2.31g/L、三水磷酸氢二钾16.43g/L和纯水。

4.根据权利要求1所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于步骤(2)中挑单菌落接种4ml LB培养基试管中，加氨苄青霉素(100mg/L)，37℃，220rpm，培养12h，得到一级种子；一级种子接种到100ml的发酵培养基的摇瓶中，37℃，220rpm，培养4h，加IPTG至终浓度1mM，28℃，220rpm，培养12h；中菌液离心收菌体，放置-20℃冰箱。

5.根据权利要求4所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于步骤(3)中菌体加3倍体积的水，用高压均质机压榨破胞两次；高速离心，获得上清酶液；酶液加入菌体量50％-200％的固定化载体EP200，20-30℃震荡混合24h；过滤，收集固定化粗酶，用磷酸钾缓冲液(20-100mM，pH7-8.5)洗涤多次，过滤，得固定化酶。

6.根据权利要求5所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于所述步骤(4)中的底物溶液包括14g/L的丙酮酸钠、10g/L的邻苯二酚、40g/L的氯化铵、2g/L的亚硫酸钠和1g/L的EDTA，调pH8.0。

7.根据权利要求6所述的一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于所述步骤(4)中：

1)固定化酶10-40g，加入1L底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；

2)每半小时添加一次底物(等量的丙酮酸钠和领苯二酚)，控制两种底物底物浓度不高于10g/L；

3)当邻苯二酚残留浓度至1g/L以下，停止反应，L-多巴浓度累积至110g/L以上；

4)反应料液过滤网，分离固定化酶活反应液及产物，截留回收固定化酶；

5)滤出的反应产物一次精制获得产品。