[发明专利]一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法与应用

说明书

本发明涉及一种固定化酶催化生产左旋多巴的方法，其特征在于：(1)挑单菌落接种到含LB培养基的试管中，加氨苄青霉素(100mg/L)30‑37℃，220rpm，培养12‑16h，得到一级种子；(2)将所述一级种子接种到含发酵培养基的摇瓶中培养10‑12h；(3)离心收菌，得到菌体，压榨破胞，加壳聚糖溶液絮凝，高速离心，获得上清酶液，加入固定化载体EP200，25℃搅拌混合12‑24h，三足式离心收集固定化酶，用50mM的磷酸钾缓冲液(pH8.0)，多次洗涤，过滤，获得固定化酶；(4)固定化酶20g，加入底物溶液，搅匀，25℃，密封震荡反应；所述底物溶液包括14‑16g/L的丙酮酸钠、10‑12g/L的邻苯二酚、40‑45g/L的氯化铵、2‑5g/L的亚硫酸钠、1‑3g/L的EDTA，调pH7.5‑8.5。

技术领域

本发明涉及一种固定化酪氨酸酚裂解酶及转化方法与应用，属于酶催化领域。

背景技术

左旋多巴(3,4-dihydroxyphenyl-L-ananine，简称L-DOPA)的化学名称为3,4-二羟基苯基丙氨酸，其结构式为：

作为一种重要的生物活性物质，L-DOPA是从L-酪氨酸到儿茶酚或黑色素的生化代谢途径过程中的重要中间产物。

上世纪60年代，国外许多学者开始致力于微生物酶法合成L-DOPA的研究。为了提高L-DOPA产量和底物转化率，研究者们对微生物酶法合成L-DOPA的工艺方法进行了大量研究。

酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine phenol lyase，TPL，E.C.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，该酶分子量约200kDa，是一个四聚体酶。TPL酶以磷酸吡哆醛(pyridoxal-phosphate，PLP)为辅酶，以钾离子和氨离子为辅助因子，TPL可以催化L-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨。由于这个反应是可逆的，将邻苯二酚代替苯酚后，可由邻苯二酚、丙酮酸和氨可在TPL催化下生成L-DOPA。左旋多巴的前体在较高浓度时对酶活都有抑制作用，其中邻苯二酚及丙酮酸除了有强抑制作用外，还会导致酶的不可逆失活，反应条件难以控制，副产物多，L-DOPA的产率低。

印度R.Krishnaveni Vandana Rathod等人利用真菌Acremoniumrutilum转化L-酪氨酸至L-多巴，酪氨酸酶比活达1095U/mg。但目前产能较低，只有0.89g/L。

巴基斯坦Ikram-Ul-Haq等人对产酪氨酸酶的Aspergillusoryzae进行紫外诱变，诱变株最大产量达1.28g/L。

埃及Doaa A.R.Mahmoud·Magda A.El Bendary利用Egyptian halophilic blackyeast的酪氨酸酶转化生成L-DOPA，产量为66μg/ml。

韩国研究人员使用酪氨酸酶进行转化时，利用电取代还原试剂，将多巴醌(DOPAquinone)还原为L-多巴，使转化率达95.9，生产强度47.27mg/L*h。