[发明专利]一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法

权利要求书

1.一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取犬的主动脉；

S2：翻转主动脉并进行清洗；

S3：得到血管内壁表面单层细胞；

S4：得到原代犬血管内皮细胞并进行体外培养。

2.根据权利要求1所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S1中包括以下步骤：

S11：取刚车祸死亡的小狗，清理尸体后进行胸腹部剃毛；

S12：打开胸腔，取心主动脉；

S13：挤出残留在血管内的淤血，用75％酒精浸泡后取出置于超净工作台内。

3.根据权利要求1所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S2中包括以下步骤：

S21：剥离附着在血管表面的结蹄组织，然后使用无菌尖头镊子将血管一端向内塞入管腔，慢慢将管腔内血管向另一端移动直至整条血管内外翻转；

S22：洗净血管内壁。

4.根据权利要求1所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S3具体包括以下步骤：

将血管转移至装有PBS的培养皿中，轻轻刮取血管内壁表面单层细胞，收集血管内壁表面单层细胞至PBS溶液中。

5.根据权利要求4所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S3中，用无菌手术刀片轻轻刮取血管内壁表面单层细胞。

6.根据权利要求1所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S4中包括以下步骤：

S41：将收集有血管内壁表面单层细胞的PBS溶液离心后弃掉上清，将离心得到的沉淀用胶原酶重悬后进行消化反应；

S42：消化反应完成后用筛网过滤后离心，将离心得到的细胞沉淀用ECM完全培养基重悬后接种至细胞培养瓶中进行培养；

S43：待培养瓶中长出细胞克隆后，小心挑取单个细胞克隆转移至新的培养瓶中进行扩大培养即得到原代犬血管内皮细胞，原代犬血管内皮细胞长满后可进行传代。

7.根据权利要求6所述的所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S41中，用I型胶原酶在37℃的条件下消化反应30-50min。

8.根据权利要求6所述的所述的原代犬血管内皮细胞的分离培养方法，其特征在于，在S42中，ECM完全培养基中含有5％血清、1％双抗和1％内皮细胞生长因子。

9.根据权利要求1-8中任意一项分离培养方法得到的犬血管内皮细胞。

10.根据权利要求9所述的犬血管内皮细胞在犬血管类疾病研究中的应用。