[发明专利]一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法在审

专利信息
申请号: 201810908934.3 申请日: 2018-08-10
公开(公告)号: CN109055298A 公开(公告)日: 2018-12-21
发明(设计)人: 詹小舒;王丙云;罗冬章;罗惠娜;陈胜锋;陈志胜;刘璨颖;白银山 申请(专利权)人: 佛山科学技术学院
主分类号: C12N5/071 分类号: C12N5/071
代理公司: 广东广信君达律师事务所 44329 代理人: 杨晓松
地址: 528000 广东省佛山市*** 国省代码: 广东;44
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摘要:
搜索关键词: 血管内皮细胞 分离培养 主动脉 翻转 成纤维细胞 胶原酶消化 细胞 单层细胞 可重复性 生物领域 体外培养 污染机会 细胞污染 血管表面 血管内壁 增殖能力 机械法 附着 刮取 成功率 清洗 剥离 车祸 死亡
【说明书】:

发明涉及生物领域,尤其涉及一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法。该分离培养方法包括以下步骤:S1:取犬的主动脉;S2:翻转主动脉并进行清洗;S3:得到血管内壁表面单层细胞;S4:得到原代犬血管内皮细胞并进行体外培养。本发明的分离培养方法具有以下优点:操作简单、可重复性好,且实验时间短;血管内皮细胞来源于车祸死亡的犬主动脉,避免了伦理争议;使用机械法刮取细胞,再与胶原酶消化法相结合,能获得大量单个的具有强增殖能力的血管内皮细胞;获得的血管内皮细胞纯度高;细胞污染的几率非常低,而且此方法翻转操作的成功率接近100%;剥离附着在血管表面的结蹄组织,大大减少了成纤维细胞等其他细胞的污染机会。

技术领域

本发明涉及生物领域,尤其涉及一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法。

背景技术

在心脑血管疾病高发的今天,疾病模型的建立及药物研发显得尤为重要。而血管内皮细胞作为心脑血管疾病最合适的模型细胞,具有分离难度大,纯度低的特点,一定程度上制约了心脑血管疾病药物研发的发展。虽然市场上已有众多血管内皮细胞系,但其与原代细胞相比已发生一定的变异,与体内生理环境下的血管内皮细胞有较大差异。犬作为最受欢迎的伴侣宠物,其血管类疾病高法同样困扰着宠物医生及主人,而市场上暂无犬来源的血管内皮细胞系,因此,因此原代分离犬血管内皮细胞技术尤为重要。

当前分离血管内皮细胞主要应用组织块法和酶消化法,并用免疫磁珠法进行纯化,此法步骤繁琐且得到细胞数量少,制约了血管内皮细胞分离纯化及其在疾病模型中应用的发展。

发明内容

为了解决上述现有的技术问题,本发明提供一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法,该方法简单,得到的原代细胞纯度高且活性好。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:

本发明一方面公开了一种原代犬血管内皮细胞的分离培养方法,包括以下步骤:

S1:取犬的主动脉;

S2:翻转主动脉并进行清洗;

S3:得到血管内壁表面单层细胞;

S4:得到原代犬血管内皮细胞并进行体外培养。

优选的,在S1中包括以下步骤:

S11:取刚车祸死亡的小狗,清理尸体后进行胸腹部剃毛;

S12:打开胸腔,取心主动脉;

S13:挤出残留在血管内的淤血,用75%酒精浸泡后取出置于超净工作台内。

优选的,在S2中包括以下步骤:

S21:剥离附着在血管表面的结蹄组织,然后使用无菌尖头镊子将血管一端向内塞入管腔,慢慢将管腔内血管向另一端移动直至整条血管内外翻转;

S22:洗净血管内壁。

优选的,在S3具体包括以下步骤:

将血管转移至装有PBS的培养皿中,轻轻刮取血管内壁表面单层细胞,收集血管内壁表面单层细胞至PBS溶液中。

更优选的,在S3中,用无菌手术刀片轻轻刮取血管内壁表面单层细胞。

优选的,在S4中包括以下步骤:

S41:将收集有血管内壁表面单层细胞的PBS溶液离心后弃掉上清,将离心得到的沉淀用胶原酶重悬后进行消化反应;

S42:消化反应完成后用筛网过滤后离心,将离心得到的细胞沉淀用ECM完全培养基重悬后接种至细胞培养瓶中进行培养;

S43:待培养瓶中长出细胞克隆后,小心挑取单个细胞克隆转移至新的培养瓶中进行扩大培养即得到原代犬血管内皮细胞,原代犬血管内皮细胞长满后可进行传代。

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