[发明专利]基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法

权利要求书

1.一种基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，该检测方法包括如下步骤：

a)以发卡状DNA为模板，加入硝酸银、硼氢化钠，使其原位还原生成DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch；发卡状DNA中含有G增强序列，变构探针AgSwitch中的DNA-银纳米簇与所述G增强序列的距离变化使得体系荧光发生变化；

b)将多个不同浓度的转录因子溶液与步骤a)得到的AgSwitch孵育反应，所述转录因子能够与变构探针AgSwitch特异性结合；

c)测定体系的荧光值，获得转录因子浓度与荧光强度的线性关系，绘制标准曲线；

d）在与步骤c）同样的条件下测定待测样品的荧光强度，根据步骤c)的标准曲线，得到待测样品中转录因子的浓度；

其中，所述发卡状DNA选自以下序列中的一种；

AgSwitch-p50的模板序列，其具有如SEQ ID NO：1所示的碱基序列，可与转录因子p50特异性结合；

AgSwitch-TBP的模板序列，其具有如SEQ ID NO：2所示的碱基序列，可与转录因子TBP特异性结合；

AgSwitch-MITF的模板序列，其具有如SEQ ID NO：3所示的碱基序列，可与转录因子MITF特异性结合。

2.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤a）中，所述DNA-银纳米簇变构探针AgSwitch通过以下步骤制备得到：将1 OD的发卡状DNA模板溶解于900 μL缓冲液 中，加热至90℃，维持15 min后阶梯降温至37℃，降温持续时间为45 min，随后加入15 μL，10 mM新制硝酸银溶液，涡旋混合后避光在冰水混合物中反应30 min，接着，迅速加入20 μL，10 mM新制硼氢化钠溶液，在涡旋混合仪上剧烈涡旋30s，沉浸入冰水混合物中10s，再涡旋30s，反复至少三次，然后避光在冰水混合物中反应过夜；所述缓冲液 为柠檬酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，所述硼氢化钠溶液用冰水配制。

4.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤b）中，所述孵育在结合缓冲液中进行，所述结合缓冲液的配方为：10 mMNa₂HPO₄/NaH₂PO₄，100 mM CH₃COONa，10 mM Mg(CH₃COOH)₂，15%甘油，0.08 mg/mL poly(dI-dC)，pH=7.4。

5.根据权利要求4所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤b）中，多个不同浓度的转录因子溶液由转录因子的母液稀释制得，所述稀释液为结合缓冲液。

6.根据权利要求5所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，多个不同浓度的转录因子溶液的浓度为0.5 nM-1.25 μM。

7.根据权利要求6所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤b）的孵育反应体系中，结合缓冲液、转录因子溶液与AgSwitch溶液的体积比为40-50：4-6：1；AgSwitch溶液的浓度为4.5-5.5 μM；孵育反应在37 ℃下进行1 h。

8.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，步骤c）包括：将孵育反应后所得样品离心，然后装入石英比色皿进行荧光检测，荧光检测条件包括：激发波长为561 nm，扫描速度为1000 nm/min，光电倍增管电压为800 V，激发狭缝和发射狭缝宽度为5 nm。

9.根据权利要求1所述的基于DNA-银纳米簇变构探针的转录因子荧光检测方法，其特征在于，所述待测样品为从实际细胞或组织样品中获得的核蛋白提取物。