[发明专利]重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物

权利要求书

1.表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒，保藏号为CGMCC No.15692；用于构建表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒的引物，所述引物见表1：

表1所需引物及酶切位点

引物Xho I-3F的酶切位点为CTCGAG；

引物EcoR I-3R的酶切位点为GAATTC；

引物Cap-F的酶切位点为GGATCC；

引物Cap-R的酶切位点为AAGCTT。

2.权利要求1所述的表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的重组杆状病毒的构建方法，其特征是，所述构建方法包括以下步骤：

(1)、构建包含PCV3全基因组的pSK-sPCV3：

以PCV3 DNA为模板，用权利要求1所述的引物Xho I-3F和引物EcoR I-3R扩增出PCV3全基因组；将PCV3全基因组胶回收后与pBluescript SK+载体同时用Xho I和EcoR I双酶切，将两种酶切产物纯化回收后进行连接，最后获得重组质粒pSK-sPCV3；

(2)、转移载体的构建：

以pSK-sPCV3重组质粒为模板，用权利要求1所述的引物Cap-F和引物Cap-R扩增PCV3Cap全长，将PCR产物纯化后与转移载体pFastBac^TMHT A共同进行BamH I和Hind III的双酶切；再次纯化后进行常规连接反应，获得重组质粒pFastBac^TMHT A-Cap；提取重组质粒pFastBac^TMHT A-Cap，分别利用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ单酶切鉴定，以及BamH I-Hind Ⅲ的双酶切鉴定；将酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，BamH I和Hind Ⅲ分别单酶切pFast Bac^TMHT A-Cap质粒，则得到5501bp单一条带；BamH I-Hind Ⅲ双酶切重组质粒pFastBac^TMHT A-Cap，则得到4856bp和645bp两个条带；

(3)穿梭质粒的构建：

将BamH I-Hind Ⅲ双酶切鉴定得到4856bp和645bp两个条带的正确重组载体pFastBac^TMHT A-Cap转化进入DH10αBac感受态细胞；蓝白斑筛选转座成功的白色单菌落，PCR鉴定正确后，抽提重组穿梭质粒Bacmid-Cap；用引物pUC/M13扩增出2430bp加上插入目的片段大小的条带，即3075bp条带；根据PCR鉴定重组Bacmid DNA模式图，推测计算pUC/M13上下游引物与目的片段上下游引物组合使用所扩增条带大小可知，用引物pUC/M13 F+CapR扩增出Bacmid-Cap重组穿梭质粒的2500bp目的条带；同理，用引物Cap F+pUC/M13 R扩增出1000bp目的条带；用引物Cap F/R分别扩增出645bp目的条带；

(4)、重组杆状病毒的获得：

将鉴定正确的重组穿梭质粒Bacmid-Cap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组杆状病毒rBac-Cap。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，PCV3全基因组胶回收后与pBluescriptSK+载体同时用Xho I和EcoR I双酶切，将两种酶切产物纯化回收后按3:1的摩尔比进行连接。

4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，通过Xho I和EcoR I双酶切鉴定重组质粒pSK-sPCV3，酶切产物用0.7％的琼脂糖凝胶进行电泳，得到大小分别为2958bp和2000bp的条带。

5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，提取重组质粒pFastBac^TMHT A-Cap利用Axygen质粒小量DNA提取试剂盒进行。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征是，步骤4所述PCR鉴定鉴定正确是参考Invirtogen公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书进行。