[发明专利]重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白及其构建方法与引物

说明书

本发明属于疫苗制造技术领域。本发明公开了一种重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白。本发明还公开了用于构建重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的引物。本发明又公开了用于重组杆状病毒表达猪圆环病毒3型Cap蛋白的构建方法，包括以下步骤：1、构建包含PCV3全基因组的pSK‑sPCV3；2、转移载体的构建；3、穿梭质粒的构建；4、重组杆状病毒的获得；将阳性穿梭质粒Bacmid‑Cap转染Sf9细胞，获得表达猪圆环病毒3型Cap基因的重组杆状病毒rBac‑Cap。本发明表达的Cap蛋白具有良好的生物学活性，免疫小鼠发现具有良好的免疫原性。

技术领域

本发明涉及表达猪圆环病毒3型(PCV3)Cap基因的重组杆状病毒的构建方法，用于制造疫苗。

背景技术

猪圆环病毒病(PCVD)是当前危害养猪业的重要疾病之一，其中PCV2是导致该类疾病的主要致病因子。2016年，Phan等学者报道了新型猪圆环病毒PCV3，该病毒可造成猪皮炎和肾病综合征(PDNS)、猪繁殖障碍呼吸系统疾病及消化系统炎症等疾病[Phan TG,Giannitti F,Rossow S,et al.Detection of a novel circovirus PCV3 in pigs withcardiac and multi-systemic inflammation[J].Virology Journal,2016,13(1):184.]。通过PCV3全基因组遗传进化分析发现，PCV3与另外PCV1和PCV2两个基因型的病毒处于不同的进化分支，且PCV3各分离株之间也存在进化差异，是新型猪圆环病毒。自PCV3被报道以来，国内外多个地区均检测出该病毒，其危害正逐步受到重视。2017年初，何启盖等在我国首次检出PCV3。目前国内的PCV3毒株主要分为3a、3b和3c三种基因型，其中3a和美国PCV3参考毒株处于相同的进化分支[Fu X,Fang B,Ma J,et al.Insights into the epidemiccharacteristics and evolutionary history of the novel porcine circovirus type3 in southern China[J].Transboundary and Emerging Diseases,2018,65(2):e296-e303.]。Stadejek等对波兰境内14个商品化猪场母猪、仔猪和育成猪的血清进行PCV3检测，证实PCV3感染在欧洲地区同样存在[Stadejek T,niak A,ek D,et al.Firstdetection of porcine circovirus type 3 on commercial pig farms in Poland[J].Transboundary and Emerging Diseases,2017,64(5):1350-1353.]。为控制PCV3的进一步流行，亟需研发针对该病毒的商品化疫苗。

PCV3与PCV1、PCV2一样为无囊膜病毒，病毒粒子也呈二十面体结构，具有2kb的单链闭合环状负链DNA基因组，包含三个最主要的开放阅读框。ORF1编码参与病毒基因组复制的相关蛋白，而ORF2编码主导免疫原性的Cap核衣壳结构蛋白，是研制PCV3亚单位基因工程疫苗的理想靶基因[Nawagitgul P,Morozov I,Bolin S R,et al.Open reading frame 2of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].Journal ofGeneral Virology,2000,81(Pt 9):2281-2287.]。PCV3 ORF3编码由231个氨基酸组成的功能未知蛋白质。PCV3与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性较低，仅为30％，此外，二者Cap蛋白的抗原表位也无任何相似性，暗示PCV3和PCV2毒株间的抗原交叉保护性可能很低，现有的PCV2疫苗已无法有效预防PCV3感染[湛洋,王东亮,王乃东,等.猪圆环病毒3型检测及其Cap结构序列和抗原性预测分析[J].畜牧兽医学报,2017,48(6):1076-1084.]。