[发明专利]一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液1，PCR反应液2，DNA内控，定量参考品A、B、C、D，强阳性质控品，临界阳性质控品和阴性质控品；所述PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、用于检测靶多核苷酸的探针、DNA内控引物及探针、PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液；所述的PCR反应液2包括20~30mMMnCl2，0.09%叠氮化钠。

2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：

所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的浓度为20~30pmol/µl，用于检测靶多核苷酸的探针浓度为10~15pmol/µl，DNA内控引物的浓度为20~30pmol/µl，DNA内控引物探针的浓度为为10~15pmol/µl，其碱基序列分别为：

靶标引物1：5’- CCTACGGATGGAAATTGCAC -3’；

靶标引物2：5’- GAGCCAAGAGAAACGGACTGA -3’；

内控引物3：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA -3’；

内控引物4：5’- CCAGTATGGAACCACGCTATGT -3’；

靶标探针1：FAM- CGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACC –BHQ1；

内控探针2：ROX- TCGGGTTTCCGTCTTGCTCGTATCGC –BHQ2。

3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述PCR反应缓冲液包括30~80mM基础缓冲液Tris和增强剂。

4.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，其特征在于：所述酶混合液包括双功能酶、UNG酶和酶保护液，其中双功能酶含量为5~10U/ul，UNG酶含量为0.1~0.5U/ul。

5.采用权利要求1的试剂盒定量检测乙型肝炎病毒核酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步，样本制备：提取强阳性质控品，临界阳性质控品、阴性质控品、定量参考品A、B、C、D以及待检测样品中的DNA，并在其中添加DNA内控，浓度为1.0E+05-1.0E+06copies/ml；

第二步，聚合酶链式反应：在80µl PCR管配制反应体系：PCR反应液1 20µl，PCR反应液210µl，模板RNA 20~60µl，将上述反应管于以下条件进行荧光定量PCR反应：50℃ 2min，93℃2min，93℃ 5s、55℃ 20s循环45次，40℃10s；

第三步，结果判断：阴性质控FAM通道No Ct，ROX通道Ct值≤40.0，强阳性质控品检测浓度应在1.0E+05-1.0E+07IU/mL范围内，临界阳性质控品Ct值≤45.0，在满足以上3个条件下，荧光定量PCR仪即可根据4个定量参考品绘制的工作曲线自动生成待测样本的检测浓度结果。