[发明专利]一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括PCR反应液1，PCR反应液2，DNA内控，定量参考品A、B、C、D，强阳性质控品，临界阳性质控品和阴性质控品；PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上、下游引物，用于检测靶多核苷酸的探针，DNA内控引物及探针，PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液。本发明的试剂盒灵敏度高，最低检出限为5IU/ml；线性范围广，可覆盖20‑1.0E+09IU/ml；特异性强，针对保守区段S区序列设计1对引物，与其他病原体无交叉干扰；扩增效率高，通过添加酶保护液稳定双功能酶的空间构象，增强了其活性；快速检测，整个检测过程在50分钟内完成；便于保存运输，无需冷冻及反复冻融，提高了用户使用的便捷性。

技术领域

本发明涉及体外诊断技术，尤其是涉及一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化，是导致人类病毒性肝炎最主要的原因。HBV感染呈世界性流行，但不同地区HBV 感染的流行强度差异很大。据世界卫生组织报道，全球约20亿人曾感染HBV，其中2.4亿人为慢性HBV感染者，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和肝细胞癌(HCC)。所以对于乙肝病毒的预防和诊疗是国家传染病控制的头等大事。

HBV 酶联免疫试剂是目前诊断乙肝的主要手段。乙肝“两对半”酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床、急诊、血液筛查等各个领域。但是，酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方法，容易造成漏检，不利于乙肝的早期诊断。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。

目前，国内已有多种基于荧光定量PCR 技术的乙肝定量检测试剂盒应用于临床检测中，这些试剂盒所提供的乙肝核酸提取方法主要是离心柱法，且扩增试剂需要于-20℃保存。该类试剂盒虽具有一定的优点，但仍存在很多不足：（1）离心柱法操作繁琐，容易导致核酸“气溶胶”污染；（2）扩增试剂-20℃的保存条件不利于保存和运输；（3）提取和扩增时间比较长，延长了患者等待时间；（4）检测灵敏度低，约在500IU/ml 左右；定量范围窄，一般在1.00E+03IU/ml ～ 1.00E+08IU/ml之间；（5) 没有设置阳性内对照( 即内标)，无法监控假阴性；（6）一般没有预防PCR 产物污染的措施。因此，研究开发一种乙型肝炎病毒（HBV）核酸定量检测试剂盒是目前急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，以期从根本上解决现有乙型肝炎病毒（HBV）核酸检测试剂盒扩增试剂需-20℃保存且扩增时间较长的技术问题。

为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：

本发明所述的乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒，包括PCR反应液1，PCR反应液2，DNA内控，定量参考品A、B、C、D，强阳性质控品，临界阳性质控品和阴性质控品；所述PCR反应液1中包括用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物、用于检测靶多核苷酸的探针、DNA内控引物及探针、PCR反应缓冲液、dNTPs、酶混合液；所述的PCR反应液2包括20~30mM MnCl2，0.09%叠氮化钠。

所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的浓度为20~30pmol/µl，用于检测靶多核苷酸的探针浓度为10~15pmol/µl，DNA内控引物的浓度为20~30pmol/µl，DNA内控引物探针的浓度为为10~15pmol/µl，其碱基序列分别为：

靶标引物1（SEQ ID No.1）：5’- CCTACGGATGGAAATTGCAC -3’；

靶标引物2（SEQ ID No.2）：5’- GAGCCAAGAGAAACGGACTGA -3’；