[发明专利]运营中的沥青路面上微生物种属及其数量确定方法

说明书

本发明目的是提供一种运营中的沥青路面上微生物种属及其数量确定方法，解决目前运营中的沥青路面微生物种属不明确和数量难以确定的问题。本发明首先根据运营中沥青路面的工作环境条件，现场采集样本，制备稀释菌液，用接种环挑取第一次富集培养液，在油平板上划线分离，三次富集后，观察在平板上形成的优势菌种，在牛肉膏蛋白胨培养基上多次划线分离，以纯化得到的单菌落；并通过16S rDNA的PCR、测序及NCBI数据库Blast比对分析，鉴定微生物类别；在无菌室内火焰旁，分别测定六个不同稀释度的菌落数。本发明提出的沥青路面微生物类别及其数量方法为沥青路面运营过程微生物对沥青的老化作用奠定基础，提出沥青路面抗微生物老化措施，延长沥青路面使用寿命。

技术领域

本发明是一种运营中的沥青路面上微生物种属及其数量确定方法，属于沥青路面技术领域。

背景技术

微生物是一个庞大的群体，在适宜的环境下会迅速大量繁殖。当前我国重视道路绿化，无论是高速公路还是城市道路，中央分隔带和路肩两侧都种满绿色植物。这些植物在美化环境，吸收噪音和尾气的同时也给微生物提供了良好的生存环境。土壤具备了各种微生物繁殖、生长发育所需要的营养、水、空气、酸碱度、渗透压和温度条件等。据统计，每克肥土中通常含有几亿至几十亿个微生物，贫瘠土壤每克也有几百万至几千万个微生物。

作为石油的提取物，沥青中的蜡对以蜡为食的微生物有较强的吸引力。微生物脱蜡技术已广泛运用在石油领域。近年来，国内外学者对能够降解石油烃类的微生物菌种做了大量研究。沥青作为石油的延伸产物，与石油有着类似的组分。在自然环境中存在着大量以烃类为唯一碳源和能源的微生物，它们在自然界分布广泛，大约有100余属，200多种，主要有细菌、放线菌、霉菌、酵母菌等。它们的细胞组分中含有较多的核糖体，能将烃类积累在细胞质膜上，也能合成较多的磷脂。能降解石油烃类的细菌菌属主要有无色杆菌属、不动杆菌属、芽孢杆菌属、假单细胞菌属、分支杆菌属等。其中最常见的是假单细胞菌，它对烷烃和芳香烃均有降解能力，且能彻底降解烷烃。降解石油烃类的放线菌菌属主要有诺卡氏菌属、放线菌属等。降解石油烃类的真菌菌属主要有假丝酵母属、曲霉属、毛霉属、青霉属等。在土壤环境中，真菌的种属比细菌还要多。通常情况下，每种微生物只对一种石油组分有较强的降解能力。

随着对石油烃降解菌的不断研究，现已有多种筛选和鉴定石油烃降解菌的方法。最常见的方法则是在特定条件下富集、驯化进行菌体纯培养，并根据其生理生化特性进行分析鉴定。传统方法是在以石油烃为唯一碳源的培养基上对样品进行富集培养，随着培养时间的延长逐渐增加石油烃的浓度，以减少非目的菌的影响。然后，采用平板涂布，进行挑单菌落划线分离得到单菌体进行纯培养，最后从形态学、生理生化特征、免疫学特性等方面加以鉴定。而目前比较创新的方法有应用聚合酶链反应(PCR)16S rDNA序列鉴定菌株、激光诱变选育高效石油烃降解菌等。

但是，目前运营中沥青路面微生物种类不明确和数量难以确定，难以进一步研究微生物对沥青材料的老化作用。因此，本发明根据运营中的不同等级公路和城市道路沥青路面实际工作环境条件，现场取样、筛选、分离沥青路面上的微生物，利用16S rDNA的PCR、测序鉴定菌种，基于活菌计数法确定样品中各种微生物的数量，从而明确运营中的沥青路面上微生物类别及数量，为进一步研究微生物对沥青路面的作用效果提供理论基础。

发明内容

(1)技术问题

本发明是提供一种运营中的沥青路面上微生物种属及其数量确定方法，解决目前运营中的沥青路面微生物种类不明确和数量难以确定的问题，为明确运营中的沥青路面上的微生物对沥青材料的老化作用奠定基础。

(2)技术方案