[发明专利]ctDNA建库试剂盒和建库方法

权利要求书

1.一种ctDNA建库试剂盒，其特征在于，包括发卡接头A、双链接头B和引物组；

所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接头A2的3′端用生物素修饰；

所述双链接头B包括接头B1和接头B2，接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5，接头引物的序列为SEQ ID NO.6-7。

2.根据权利要求1所述的ctDNA建库试剂盒，其特征在于，还包括用于连接ctDNA和发卡接头A或双链接头B的T4 DNA连接酶和用于T4 DNA连接酶的缓冲液。

3.一种ctDNA建库的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)提取游离ctDNA片段；

(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应；

(3)将步骤(2)中的产物和T4 DNA连接酶、发卡接头A混合进行接头连接反应，并进行纯化；

(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化；

(5)将步骤(4)中的产物和T4 DNA连接酶、双链接头B混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱；

(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增，得到ctDNA文库。

4.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，还包括(7)对ctDNA文库进行测序。

5.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的反应体系为：ctDNA 20μl，10×T4 RNA ligation buffer 8μl，2％Tween 2μl，Fast AP 1μl，灭菌水14.6μl；反应程序为：37℃10min，95℃2min。

6.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的反应体系为：PEG-8000(50％)32μl，发卡接头A(10μM)1μl，T4 DNA ligase 1μl，100mM ATP 0.4μl；反应程序为：37℃1h，95℃1min。

7.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(4)中的反应体系为：灭菌水39.1μl，5×Klenow reaction buffer 5μl，dNTP mix(25mM each)0.4μl，Extension primer CL130(100μM)1μl，1％Tween-20 2.5μl。

8.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的反应体系为：灭菌水73.5μl，10×T4 DNA ligation buffer 10μl，PEG-4000(50％)10μl，Tween 20(1％)2.5μl，双链接头B 2μl。

9.根据权利要求3所述的ctDNA建库的方法，其特征在于，所述步骤(6)中的反应体系为：灭菌水7.5μl，IS7 1μl，IS8 1μl，Libary 3μl，Mix 12.5μl；反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、40个循环，72℃延伸5min。