[发明专利]ctDNA建库试剂盒和建库方法

说明书

本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种ctDNA建库试剂盒和建库方法；包括发卡接头A、双链接头B和引物组；所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接头A2的3′端用生物素修饰；所述双链接头B包括接头B1和接头B2，接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5，接头引物的序列为SEQ ID NO.6‑7；本发明提供的试剂盒灵敏度高，能提高ctDNA测序通量和测序准确性。

技术领域

本发明属于分子基因学领域，具体涉及一种ctDNA建库试剂盒和建库方法。

背景技术

ctDNA，即循环肿瘤DNA，是体内循环肿瘤细胞和肿瘤组织在细胞代谢时留在血浆中的残留物。科学研究发现，利用测序技术对ctDNA进行高通量分析，即可根据基因突变信息来指导抗肿瘤药物选用、疗效评估、预后判断，甚至早期发现和早期诊断。然而，血浆中的ctDNA浓度极低，且多为小片段分子，提取困难，丢失量大，检测灵敏度低，这为测序文库的制备带来了挑战。目前市场上ctDNA建库的方法是在双链DNA末端补平加A，然后再加接头进行扩增。然而，由于ctDNA的高度片段化特点，导致部分ctDNA无法补平加接头，造成了ctDNA的损耗，使一些基因突变位点无法被检测到，限制了检测灵敏度。

申请号为CN201710116455.3的专利申请，试图通过单链连接酶解连接接头决上述问题，虽然提高了一定的检测灵敏度，但是单链连接酶对单链DNA分子具有很强的环化作用，并且单链连接酶连接时对DNA单链末端存在碱基偏好性由强到弱依次为T>A>G>C，从而影响了检测灵敏度，因此仍然需要更加行之有效的方案以弥补现有技术的不足。

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种高灵敏性的ctDNA建库的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种ctDNA建库试剂盒，包括发卡接头A、双链接头B和引物组；

所述发卡接头A包括接头A1和接头A2，接头A1和接头A2的序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接头A2的3′端用生物素修饰；

所述双链接头B包括接头B1和接头B2，接头B1和接头B2的序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述引物组包括扩增引物和接头引物，扩增引物的序列号为SEQ ID NO.5，接头引物的序列为SEQ ID NO.6-7。

所述SEQ ID NO.1-7所示的引物如下表所示：

上述技术方案产生的有益效果在于：上述试剂盒提供了构建ctDNA文库需要的接头和特异性引物，可高效的制备用于illumina等测序平台的ctDNA文库，提高ctDNA测序通量和测序准确性。

本发明的另一个目的是利用上述试剂盒构建ctDNA文库的方法，包括如下步骤：

(1)提取游离ctDNA片段；

(2)对ctDNA片段进行去磷酸化与变性反应；

(3)将步骤(2)中的产物和T4DNA连接酶、发卡接头A混合进行接头连接反应，并进行纯化；

(4)将步骤(3)中的产物和引物混合进行退火和延伸反应，并进行纯化；

(5)将步骤(4)中的产物和T4DNA连接酶、双链接头B混合进行接头连接反应，并进行纯化、洗脱；

(6)将步骤(5)中的产物和接头引物混合进行PCR扩增，得到ctDNA文库。