[发明专利]一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法在审
| 申请号： | 201810915252.5 | 申请日： | 2018-08-13 |
| 公开（公告）号： | CN108949673A | 公开（公告）日： | 2018-12-07 |
| 发明（设计）人： | 赵成诚;黄祥宏;李娜 | 申请（专利权）人： | 武汉华联科生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077 |
| 代理公司： | 北京天盾知识产权代理有限公司 11421 | 代理人： | 杨本官 |
| 地址： | 430000 湖北省武汉市武昌区*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 心肌细胞 胎鼠 重悬 胎牛血清 原代分离 胶原酶 上清液 大鼠 胰酶 红细胞裂解液 消化 成纤维细胞 细胞重悬液 细胞 不易变形 取上清液 细胞悬液 自然沉淀 培养箱 裂解 显微镜 去除 成活率 跳动 心脏 观察 | ||
1.一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将孕19～22天的胎鼠心脏剪成约0.5～1.5mm3大小的组织块，用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，再在36.5～37.5℃培养箱中消化4～6min，自然沉淀，弃去上清液；
(2)用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬8～12s，静置，取上清液，重复该步骤3～5次，每次分离的上清液加8％～12％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；
(3)将细胞悬液去未消化组织，再以800～1200r/min离心分离8～12min，重复2～4次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解4～6min；
(4)用含8％～12％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养150～200min，之后去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为4.5～5.5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。
2.根据权利要求1所述一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，步骤(1)之前将刚取出的心脏立即放入预冷的PBS中，冲洗3次。
3.根据权利要求1所述一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，步骤(3)中将收集的细胞悬液过180～220目孔径的不锈钢网来去未消化组织。
4.根据权利要求1所述一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，其特征在于，步骤(4)中采用差速铁壁分离技术去除成纤维细胞。
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