[发明专利]一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法

说明书

本发明提供的一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，包括以下步骤：胎鼠心脏剪成约0.5～1.5mm³大小，用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，在37℃培养箱中消化，自然沉淀，弃上清液；用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，静置，取上清液，分离的上清液，加8％～12％胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液；去未消化组织，离心，在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解；用含8％～12％胎牛血清的DMEM重悬，置于CO2培养箱中培养，去除成纤维细胞，吸取细胞重悬液，调整细胞浓度，最后置于CO2培养箱中培养。本发明采用本方法分离出来的心肌细胞纯度高、不易变形，通过显微镜的观察，可以明显的可看出分离出来的细胞在跳动，因此采用本方法分离出来的心肌细胞的活力较强，成活率高。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种大鼠胎心肌细胞原代分离方法。

背景技术

心肌细胞是动物生长发育、生理、代谢的重要细胞之一。为了方便研究心肌细胞的生理功能、观察细胞形态，需要排出体内各种限制因素对心肌细胞的影响，采用体外分离的方法进行培养以便观察研究。

现阶段存在一些心肌细胞分离方法，但是这些方法至少存在两个弊端，其一，由于心肌细胞位于心脏的心肌组织内，试验人员分离心肌细胞时，通常需要向离体的心脏中注射消化液，待消化完成后才收集心肌细胞，而由于分离心肌细胞时，心脏已经离体，缺乏保护、长时间的消化作用容易引起心肌细胞变形，降低心肌细胞的存活率；其二现阶段大家常采用大鼠心肌细胞直接进行原代分离，但是由于鼠龄较大，细胞活力较弱，所以分离出来的细胞纯度相对较低，同时活力也相对较差。

发明内容

本发明针对上述问题提供一种方法简单、细胞成活率高、分离纯度高的大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法。

本发明提供的一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，包括以下步骤：

(1)将孕19～22天的胎鼠心脏剪成约0.5～1.5mm³大小的组织块，用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬，再在36.5～37.5℃培养箱中消化4～6min，自然沉淀，弃去上清液；

(2)用0.1％～0.15％的胰酶+0.08％～0.12％Ⅱ型胶原酶重悬8～12s，静置，取上清液，重复该步骤3～5次，每次分离的上清液加8％～12％胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打制成细胞悬液；

(3)将细胞悬液去未消化组织，再以800～1200r/min离心分离8～12min，重复2～4次，之后在4℃的环境的红细胞裂解液中裂解4～6min；

(4)用含8％～12％胎牛血清的DMEM重悬后，置于CO2培养箱中培养150～200min，之后去除成纤维细胞，然后吸取细胞重悬液，调整细胞浓度为4.5～5.5x10^5细胞/ml，再将单细胞悬液接种于培养板中，最后置于CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每天隔天换液。

作为本发明的进一步优化，步骤(1)之前将刚取出的心脏立即放入预冷的PBS中，冲洗3次。

作为本发明的进一步优化，步骤(3)中将收集的细胞悬液过180～220目孔径的不锈钢网来去未消化组织。

作为本发明的进一步优化，步骤(4)中采用差速铁壁分离技术去除成纤维细胞。

本发明提供的一种大鼠胎鼠心肌细胞原代分离方法，采用本方法分离出来的心肌细胞纯度高、不易变形，通过显微镜的观察，可以明显的可看出分离出来的细胞在跳动，因此采用本方法分离出来的心肌细胞的活力较强，成活率高。

附图说明

图1是使用本方法分离出来的心肌细胞图；

图2是成年大鼠细胞与胎鼠细胞存活率对比图。