[发明专利]一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于包括下列核酸序列：

序列H1：5’端为a区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区；

序列H2：5’端为b区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区；

序列H3：5’端为c区，中间为茎环结构，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区；

其中目标核酸序列3’端为a*区，a与a*、b与b*、c与c*互补配对。

2.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：

H1序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中5’端序列gcttga为a区，中间序列gatgttagggagtagtgc-tccaatcacaac-gcactactccct为茎环结构，环部分序列为tccaatcacaac，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有b*区，b*区序列为ctccct；

H2序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中5’端序列agggag为b区，中间序列tagtgcgttgtgattgga-aacatctcaagc-tccaatcacaac为茎环结构，环部分序列为aacatctcaagc，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有c*区，c*区序列为cacaac；

H3序列：其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，其中5’端序列gttgtg为c区，中间序列attggagcttgagatgtt-gcactactccct-aacatctcaagc为茎环结构，环部分序列为gcactactccct，其中茎环结构的茎结构中靠近3’端的一侧包含有a*区，a*区序列为tcaagc。

3.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：目标核酸序列为单链，包含10～40个碱基。

4.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：a、a*、b、b*、c、c*区具有4～8个碱基。

5.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：序列H1、H2、H3中的茎环结构的环结构具有10～15个碱基。

6.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：序列H1、H2、H3中的茎结构中一侧具有14～22个碱基与另一侧的碱基互补配对。

7.根据权利要求1所述的一种基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大检测试剂盒，其特征在于：还包括反应缓冲液和铜纳米簇合成缓冲液，所述的反应缓冲液和铜纳米簇合成缓冲液均为含盐离子浓度的缓冲体系。

8.采用权利要求1所述的试剂盒检测基于Y型DNA模板荧光铜纳米簇的核酸信号放大方法，其特征在于包括如下步骤：

1)将所述核酸序列H1、H2和H3加入到待测样品液中，室温反应1～2h后，加入20～200U核酸外切酶Ⅲ，反应30～60min；

2)向步骤1)中加入铜纳米簇合成缓冲液和抗坏血酸钠混匀，加入后抗坏血酸钠的终浓度1～4mM，再加入硫酸铜溶液，加入后硫酸铜溶液的终浓度0.1～0.5mM，室温反应10min；

3)测试步骤2)中溶液的荧光强度，测试参数为激发波长：340nm，扫描范围：510-640nm，夹缝：15/15nm，扫描速度：600nm/min；

所述核酸序列H1、H2和H3中的反应缓冲液为pH＝8.0的20mM Tris-HCl，包含100～500mM氯化钠，10～30mM氯化钾，5～20mM氯化镁；

所述铜纳米簇合成缓冲液为pH＝7.6的10mM 3-吗啉丙磺酸，包含100～250mM氯化钠；

4)将H1、H2和H3链于95℃退火5min，形成茎环结构，当存在目标序列时，目标核酸的a*区与H1的a区结合，激活支点介导的催化发夹组装反应，依次循环打开H2和H3的茎环结构，最终形成大量的Y型DNA结构用于原位合成荧光铜纳米簇。