[发明专利]一种低免疫原性、可诱导凋亡的IPS细胞制备方法

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因修饰的iPS细胞及其制备方法。本发明提供了敲除B2M基因且表达FKBP‑Caspase9融合蛋白的iPS细胞，该iPS细胞的免疫原性较低，且可受控程序性凋亡。而由于进行的修饰是基因组级别的基因修饰，因此免疫原性的降低以及可受控程序性凋亡均可保持稳定性，并使分化获得的细胞保持这一特点。免疫原性降低有益于异体回输，可受控程序性凋亡提高了细胞的安全性，B2M基因敲除后，不能形成正常的MHCI，细胞免疫原性降低，此单克隆细胞株全部无B2M蛋白表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因修饰的iPS细胞及其制备方法。

背景技术

细胞治疗(cell therapy)是利用正常或生物工程改造过的人体细胞，对组织、器官进行修复的治疗方法。一般来讲，细胞治疗包括肿瘤细胞免疫治疗，以及干细胞治疗两大类。目前，细胞治疗在治疗癌症、血液病、心血管病、糖尿病、老年痴呆症等方面显示出越来越高的应用价值。

干细胞(stem cell)具有自我更新能力以及多向分化潜能，具有再生为各种组织器官和人体的潜力，虽然目前干细胞治疗应用仍在探索阶段，应用案例还较少，但干细胞治疗拥有广阔的前景，而且干细胞治疗应用范围很广，例如：治疗神经系统疾病、免疫系统疾病、替换受损细胞，组织，器官等。然而，干细胞制备成本较高，而且受年龄等因素影响，患者未必能够及时、有效的获得所需的干细胞。

iPS细胞，英文全称为Induced pluripotent stem cells，中文全称是诱导性多能干细胞，是由体细胞诱导而成的干细胞，具有和胚胎干细胞类似的发育多潜能性。iPS细胞的获得方法相对简单和稳定，不使用胚胎细胞或卵细胞，不仅在伦理上占有优势，更扩大了干细胞的来源范围，使更多患者能够有机会利用iPS技术获得所需的干细胞。另一方面，虽然iPS细胞在细胞治疗中表现出优良的性能，但研究表明iPS细胞中的外源的诱导因子(Oct4，sox2，cMyc，klf4)的存在，增加了iPS在细胞治疗中转化为癌细胞的风险。因此，为了确保iPS细胞治疗的安全，而降低iPS细胞的免疫原性、降低iPS细胞的肿瘤化风险，对干细胞异体移植具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供基因修饰的iPS细胞及其制备方法，该iPS细胞免疫原性低、可受控程序性凋亡。

本发明提供的基因修饰的iPS细胞，其表达FKBP-Caspase9融合蛋白，且不表达B2M蛋白。

本发明所述iPS细胞的制备方法，采用Cas9技术敲除iPS细胞的B2M基因；采用慢病毒感染法或定点敲入技术使iPS细胞表达FKBP-Caspase9融合蛋白。

本发明中，所述B2M基因的敲除采用含有SEQ ID NO.1所示序列的载体。

本发明中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表达基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中，所述表达FKBP-Caspase9融合蛋白基因的慢病毒表达载体为pLenti-CMV/To-Neo。

本发明还提供了靶向敲除iPS细胞B2M基因的Cas9/gRNA载体，其含有SEQ ID NO.1所示的序列。

本发明还提供了FKBP-Caspase9融合蛋白的慢病毒表达载体，其含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明所述的iPS细胞在制备用于细胞治疗的产品中的应用。

本发明还提供了一种用于细胞治疗的产品，其包含本发明所述的iPS细胞。

本发明还提供了一种低致瘤风险的细胞治疗方法，其为：给予本发明所述的iPS细胞，当发生肿瘤化风险时给予AP1903。