[发明专利]一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法

说明书

本发明公开了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，属于基因工程技术领域。计算异戊二烯工程菌所有外源基因的翻译起始效率，根据外源基因的翻译起始效率选择一个或多个待优化的非限速酶基因，通过置换非限速酶的核糖体结合位点核苷酸序列调低非限速酶基因的翻译起始效率。本发明通过针对非限速酶的代谢工程手段，改变非限速酶的核糖体结合位点进而提高了异戊二烯工程菌的产量，具有很好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95%用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来 源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法（包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法）和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。以可再生的生物质为原料，利用生物转化技术合成异戊二烯，因具有可持续性、环境友好、品质优异等优势，已成为国际上的研究热点。

生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸（MVA）途径和甲基赤藓糖-4-磷酸（MEP）途径。这两类代谢途径的最终产物都是形成异戊二烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP），之后经过异戊二烯合成酶催化DMAPP至异戊二烯。目前，将大肠杆菌中的MEP途径过表达，或者直接导入外源MVA途径，同时导入植物来源的异戊二烯合酶，通过发酵可以实现异戊二烯的生物合成。但是，要实现在工业上通过生物法生产异戊二烯，还需要进一步的深入研究。

在构建的异戊二烯工程菌中，从初始物质乙酰辅酶A到异戊二烯的合成涉及到8步反应，7个酶，包括来源于粪肠球菌（Enterococcus faecalis）的乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因MvaE和3-羟-3甲基戊二酰辅酶A合酶MvaS、来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因 IDI1，以及来源于甘薯（Ipomoea batatas）的异戊二烯合酶IspS_ib。在代谢途径中，研究证明其中ERG12、IDII以及IspS_ib是限速酶，而MvaE、MvaS、ERG8、ERG19是非限速酶。这7个酶表达的平衡对于代谢流是非常重要的。为了能够实现代谢的平衡，防止中间产物的积累，提高异戊二烯产量，需要对限速酶进行优化，包括增加其表达量，提高其酶活性等。然而，非限速酶对于代谢平衡也有着重要的作用，非限速酶的过量表达能够导致中间产物过剩，代谢阻滞，严重影响工程菌产量。因此针对非限速酶的研究也是非常必要的。

发明内容

为了解决上述异戊二烯工程菌代谢阻滞的问题，提供了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，采用的技术方案如下：

本发明的目的在于提供了一种通过改变非限速酶的核糖体结合位点提高异戊二烯工程菌产量的方法，该方法是计算异戊二烯工程菌所有外源基因的翻译起始效率，外源基因包括限速酶基因和非限速酶基因，统计出所有翻译起始效率高于限速酶基因翻译起始效率的非限速酶，然后从中选择一个或多个非限速酶基因通过置换其核糖体结合位点核苷酸序列调低其翻译起始效率。

优选地，选择乙酰辅酶A酰基转移酶/羟甲基戊二酰辅酶A还原酶基因mvaE通过用如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列置换其如SEQ ID NO.1所示的原始核糖体结合位点核苷酸序列来调低其翻译起始效率；或选择甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19通过用如SEQ IDNO：6所示的核苷酸序列置换其如SEQ ID NO：4所示的原始核糖体结合位点核苷酸序列来调低其翻译起始效率。