[发明专利]一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法

权利要求书

1.一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于：

包括如下步骤：

Stra8基因3’UTR序列的获得；

（2）Stra8基因靶向miRNA预测；

（3）最佳miRNA筛选；

（4）验证miRNA通过stra8对精原干细胞减数分裂的作用；

（5）体内验证miRNA对公鸡生精的影响。

2.根据权利要求1所述的一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于，步骤（1）具体为：通过NCBI提供的鸡Stra8 CDS序列，设计3’RACE 引物；以如皋黄鸡睾丸提取RNA反转录形成的cDNA为模板，利用3’RACE技术获得Stra8基因的3’UTR序列，纯化回收后测序。

3.根据权利要求2所述的一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于，步骤（2）具体为：利用miRBasehttp://www.mirbase.org/获得4个鸡的miRNA的序列，分别为>gga-mir-1a-1 MI0001247，>gga-mir-1b MI0001254，>gga-mir-31 MI0001276，> gga-mir-218-1 MI0001212，这四个miRNA都能靶向Stra8基因。

4.根据权利要求3所述的一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于，步骤（3）具体为：分别构建四个miRNA的模拟物，并构建Stra8-3’UTR过表达载体，取2支EP管，先加50μl的无血清DMEM培养基，一支EP管加0.211μg质粒：包括10 ngSTRA8-3'UTR+1 ngpRL-TK +200 ng miRNA质粒，混匀；另外一支EP管加0.633μl Lipofectamine™ 2000转染试剂混匀，约5min后将两管液体合到一管，混匀后，室温放置15min-20min后，均匀滴加到提前换过液的293T细胞中，后置于CO₂培养箱中培养；转染24h后收样；根据Promega双报告基因检测试剂盒说明书操作进行检测，并突变抑制活性最佳的miRNA靶向Stra8的靶位点，进行进一步双报告基因检测，同时构建最佳miRNA的抑制物。

5. 根据权利要求4所述的一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于，步骤（4）具体为：miRNA慢病毒载体侵染SSC，设计6组进行试验：（1）自分化空白对照（Blank）;（2）RA组（RA）；（3）miR-NC+RA组；（4）miR-31+RA组（miR-31）；（5）miR-31+miR-31i+RA组（miR-31+miR-31i）；（6）miR-31i+RA组（miR-31i），利用碧云天细胞周期检测试剂盒对单倍体进行检测，同时利用qRT-PCR对减数分裂相关基因进行检测，以及Western Blot对STRA8蛋白表达量进行检测。

6. 根据权利要求5所述的一种研究Stra8基因在如皋黄鸡生精过程中功能的方法，其特征在于，步骤（5）具体为：对性成熟的公鸡进行睾丸注射，从公鸡右侧最后一根肋骨后方0.5cm处切开，找到睾丸，进行打点注射，注射总量为100 μL，病毒量为10⁷TU，注射20天后，进行采精，每3天采精一次，连续采集5次，进行精子计数；睾丸注射50天后，对睾丸进行取样，睾丸横切10 mm×10 mm大小，进行HE染色，并对睾丸组织中的减数分裂相关基因进行qRT-PCR定量检测，以及Western Blot对STRA8蛋白表达量进行检测。